Name: a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00
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This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer's Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer's Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

NOTA:. Uno schema del protocollo generale qui descritto è dato in figura 1 Tutti i campioni utilizzati per lo sviluppo di questo metodo sono campioni diagnostici clinici in eccesso e hanno l&#39;approvazione etica dal Comitato Etico London Bloomsbury. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig1.jpg" /> Figura 1. Schema Illustrando il processo globale di creare un mirate CSF MRM peptidi <s...

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	<li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+novel+cerebrospinal+fluid+biomarkers+for+staging+early+Alzheimer's+disease.">Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).</li><li>Liguori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexinergic+system+dysregulation,+sleep+impairment,+and+cognitive+decline+in+Alzheimer+disease.">Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease.</a> JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).</li></ol>

Come con tutti i test basati MS, le fasi critiche del metodo sono la determinazione degli importi appropriate ed esatte degli standard interni. Se si utilizza la quantificazione assoluta, quindi la corretta quantità di peptidi a spillo nella curva standard sono anche critici. Il nostro test non richiede la precipitazione del CSF o l&#39;uso di qualsiasi tipo di puliti gradini o dissalazione prima dell&#39;analisi MS - è un metodo di reazione one-pot interamente. A causa del piccolo volume ...

L&#39;impatto crescente delle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, demenza Lewy e la malattia di Parkinson, sta diventando un problema socio-economico in molti paesi 1. Vi è la necessità di biomarker aggiuntivi che possono essere utilizzati per identificare e classificare i pazienti nei primi stadi della malattia, e per monitorare eventuali nuovi trattamenti. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di creare una pipeline generico per un modo semplificato, economico e più veloce di validare potenziali marcatori CSF di neurodegenerazione. La logica è quella di utilizzare la proteomica mirati o peptide MRM LC-MS / MS come un metodo facilmente modificabili per valutare molteplici potenziali biomarcatori proteici da esperimenti di scoperta. Questi possono essere ulteriormente multiplexing su una separazione rapida cromatografica (&lt;10 min) e valutati. All&#39;interno di questa schermata multiplex per biomarcatori neurodegenerative, abbiamo incluso la demenza noto fattore di rischio apolipoproteina E4 isoforma (ApoE4) in modo che CAn determinare contemporaneamente il suo stato e livello di espressione, da tale eliminando la necessità di test di genotipizzazione separati 2. LC MS / MS è abitualmente utilizzato come metodo di scelta per quantificazione con precisione piccole molecole rispetto ad altri metodi, quali ELISA o radioimmunologico (RIA). Questo cambiamento nell&#39;uso della tecnologia MS alle proteine ​​analisi, è stata guidata principalmente da questioni con le tecnologie immuno-based. Questi includono cross-specificità, variazione tra le partite, durata limitata, e il costo elevato. Pertanto, la proteomica mirati sta rapidamente diventando una crescente alternativa ai metodi di anticorpi based come Western blotting, RIA ed ELISA. Tuttavia, la capacità di multiplex molti marcatori in un saggio è il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi immuno-base 3. La tecnica è applicabile a molti tessuti ed è stato usato come una strategia di convalida per studi molti proteomica compreso plasma 4 e nelle urine 5,6. Il technique può essere applicato a qualsiasi laboratorio che ha accesso e la competenza nell&#39;uso triple spettrometri di massa quadrupolo. disegno Peptide è relativamente semplice con il crescente utilizzo di database open source. Il mercato competitivo della sintesi peptidi personalizzati li rende molto più conveniente. peptidi pesanti, però, sono costosi e, pertanto, gli indicatori dovrebbero essere valutati su una piccola coorte prima di passare ad una scala più ampia. Vi è un crescente potenziale per la tecnica da utilizzare nelle impostazioni di diagnostica clinica, con la maggior parte dei grandi ospedali con le piattaforme basate triplo quadrupolo che possono essere facilmente adattati per eseguire analisi proteomica mirati. Una tale applicazione del metodo, rendendo nel setting diagnostici di routine, è la sua recente richiesta di proiezione macchia di sangue neonatale per l&#39;anemia falciforme 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetonitrile (ACN), LC-MS grade&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A955-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid, LC-MS grade,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D5545-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BDH3028-2.5LG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">I1149-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water, LC-MS ULTRA Chromasolv</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14263</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Custom synthesised peptides desalted 1-4mg</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">ASB 14</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">182750-25gm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Thiourea</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7875-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6066</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">VanGuard precolumn</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Cortecs UPLC C18+ 1.6um&#160; 2.1 x50mm column</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Yeast Enolase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6126</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">300ul clear screw top glass vials&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-FISV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Y slit screw caps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">9SCK-(B)-ST1X</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:71px;">Edwards Mudulyo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Mudulyo system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Concentrator/Speed vaccum</td>
			<td style="width:71px;">Eppendof&#160;</td>
			<td style="width:119px;">concentrator&#160; plus 5301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Xevo -TQ-S mass spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status

Molte malattie neurodegenerative mancano ancora trattamenti efficaci. biomarcatori affidabili per l&#39;identificazione e la classificazione di queste malattie saranno importanti per lo sviluppo di future terapie innovative. Spesso i potenziali nuovi biomarcatori non rendono in clinica a causa di limitazioni nel loro sviluppo e costi elevati. Tuttavia, la proteomica mirati che utilizzano reazione multipla Monitoraggio cromatografia liquida-tandem / Spettrometria di Massa (MRM LC-MS / MS), in particolare utilizzando triple spettrometri di massa a quadrupolo, è un metodo che può essere utilizzato per valutare rapidamente e validare biomarcatori per la traduzione clinica in laboratori diagnostici . Tradizionalmente, questa piattaforma è stato ampiamente utilizzato per la misurazione di piccole molecole in laboratori clinici, ma è la possibilità di analizzare le proteine, che lo rende una valida alternativa ai ELISA (Enzyme-Linked Immunosorpiegato Assay) a base di metodi. Descriviamo qui come proteomica mirata può essere utilizzato per misurare i marcatori multiplex di demenza, tra cui il rilevamento e la quantificazione del noto fattore di rischio apolipoproteina E isoforma 4 (ApoE4). Al fine di rendere il saggio adatto per definizione, è progettato per essere rapido, semplice, altamente specifico e redditizio. Per raggiungere questo obiettivo, ogni passo nello sviluppo del dosaggio deve essere ottimizzato per le singole proteine ​​e dei tessuti che sono analizzate in. Il metodo descrive un flusso di lavoro tipico tra cui vari suggerimenti e trucchi per lo sviluppo di una proteomica mirata MRM LC-MS / MS per la traduzione . Lo sviluppo del metodo è ottimizzato utilizzando le versioni sintetizzate personalizzato di peptidi quantotypic tryptic, che calibrare la MS per il rilevamento e poi a spillo in CSF per determinare la corretta identificazione del peptide endogena nella separazione cromatografica prima dell&#39;analisi nel MS. Per raggiungere absoluTE quantificazione, versioni standard interni marcati con isotopi stabili dei peptidi con breve aminoacidi tag sequenza di acido e che contiene un sito di taglio tripsina, sono inclusi nel saggio.

Utilizzando il metodo sopra descritto, un saggio multiplex high throughput 10 min composta da 74 peptidi 54 proteine è stato sviluppato, come dosaggio per i marcatori di disturbi neurodegenerativi morbo di Alzheimer e demenza Lewy (LBD) 8. La figura 3 mostra un cromatogramma multiplex pubblicato in precedenza 8 dei marcatori peptidici significative dal test. I peptidi incluse nel dosaggio e loro transizioni quantitative sono riportati nella <strong...

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A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Descriviamo un alto rendimento, multiplex, e il dosaggio mirato liquido cerebrospinale proteomica (CSF) sviluppata con un potenziale per la traduzione clinica. Il test può quantificare potenziali marcatori e fattori di rischio per la neurodegenerazione, come le varianti apolipoproteina E (E2, E3 e E4), e misurarne l&#39;espressione allelica.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

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