Name: a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00
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This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer's Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer's Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

注：ここで説明するプロトコル全体の概略Fi回線 グレ1に与えられている。この方法の開発のために使用されるすべての試料は黒字臨床診断サンプルがあり、ロンドンブルームズベリー倫理委員会から倫理的承認を持っています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig1.jpg" /> 評価対象のCSF MRM LC-MS / MSアッセイ</...

<ol>
	<li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).</li><li>Hirtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+new+quantitative+mass+spectrometry+and+semi-automatic+isofocusing+methods+for+the+determination+of+Apolipoprotein+E+typing.">Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing.</a> Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics.">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).</li><li>Heywood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+peptide+SRM-based+tandem+mass+spectrometry+assay+for+prenatal+screening+of+Down+syndrome.">The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome.</a> J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).</li><li>Heywood, W. 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すべてのMSベースのアッセイと同様に、この方法での重要なステップは、内部標準の適切かつ正確な量の決意です。絶対的定量を使用している場合は、標準曲線におけるスパイクペプチドの正確な量も重要です。 私たちのアッセイは、CSFの沈殿またはMS分析前にクリーンアップまたは脱塩工程のいずれかのタイプを使用する必要はありません - それは完全にワンポット反?...

アルツハイマー病などの神経変性疾患の成長への影響、レビー小体型認知症とパーキンソン病は、多くの国1での社会経済的な課題となっています。識別し、疾患の初期段階で患者を分類し、任意の潜在的な新しい治療法を監視するためにするために使用することができる追加のバイオマーカーが必要とされています。この方法の全体的な目標は、神経変性の潜在的CSFマーカーの検証の合理化、経済的かつ迅速な方法のための一般的なパイプラインを作成することです。理論的根拠は、検出実験から複数の潜在的タン​​パク質バイオマーカーを評価するために容易に修正可能な方法としてターゲットプロテオミクスまたはペプチドのMRM LC-MS / MSを使用することです。これらは、さらに迅速なクロマトグラフィー分離（&lt;10分）上で多重化して評価することができます。神経変性のバイオマーカーのためのこの多重画面の中で、我々は知られている認知症の危険因子のアポリポタンパク質アイソフォームE4（ApoE4のを）含まれているので、我々は、CAnはそれが別々の遺伝子型判定テスト2の必要性を排除することによって、同時にその発現状況とレベルを決定します。 LC MS / MSは、定期的に正確例えばELISAまたはラジオイムノアッセイ（RIA）などの他の方法を介して小分子を定量するための最適な方法として使用されています。タンパク質を分析するMS技術の使用におけるこのシフトは、免疫ベースの技術の問題を中心に駆動されました。これらは、クロス特異性、バッチバッチ変動に、限られた貯蔵寿命、および高いコストが含まれます。したがって、目標とプロテオミクスは、急速に、ウエスタンブロット法、RIAおよびELISAなどの抗体ベースの方法への成長の代替になってきています。しかし、1つのアッセイに多数のマーカーを多重化する能力は、免疫ベースの方法3に対するこの技術の主要な利点です。技術は、多くの組織に適用可能であり、プラズマ4及び尿5,6を含む多くのプロテオミクス研究の検証戦略として使用されています。 テchniqueは、トリプル四重極質量分析計を使用してアクセスし、専門知識を持っている任意の研究室にも適用することができます。ペプチド設計は、オープンソースデータベースの利用拡大と比較的単純です。カスタムペプチド合成の競争市場は、それらをはるかに手頃な価格になります。重いペプチドは、しかし、高価であり、したがって、マーカーは、大規模に移動する前に、小さな集団で評価されるべきです。最も大きな病院は容易にターゲットプロテオミクスアッセイを実行するために適合させることができるトリプル四重極ベースのプラットフォームを有する、臨床診断設定で使用される技術のための成長可能性があります。日常的な診断の設定にそれを作る方法の一つのようなアプリケーションは、鎌状赤血球貧血7のための新生児の血液スポットスクリーニングへの最近のアプリケーションです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetonitrile (ACN), LC-MS grade&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A955-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid, LC-MS grade,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D5545-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BDH3028-2.5LG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">I1149-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water, LC-MS ULTRA Chromasolv</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14263</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Custom synthesised peptides desalted 1-4mg</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">ASB 14</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">182750-25gm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Thiourea</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7875-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6066</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">VanGuard precolumn</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Cortecs UPLC C18+ 1.6um&#160; 2.1 x50mm column</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Yeast Enolase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6126</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">300ul clear screw top glass vials&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-FISV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Y slit screw caps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">9SCK-(B)-ST1X</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:71px;">Edwards Mudulyo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Mudulyo system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Concentrator/Speed vaccum</td>
			<td style="width:71px;">Eppendof&#160;</td>
			<td style="width:119px;">concentrator&#160; plus 5301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Xevo -TQ-S mass spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status

多くの神経変性疾患は、まだ有効な治療を欠いています。これらの疾患を識別し、分類するための信頼性のあるバイオマーカーは、将来の新しい治療法の開発に重要になります。多くの場合、潜在的な新規バイオマーカーは、それらの開発と高コストの制限のために診療所にそれをしないでください。しかし、具体的に三連四重極質量分析計を用いて、液体クロマトグラフィー - タンデム/質量分析法（MRM LC-MS / MS）の多重反応モニタリングを用いて標的プロテオミクスは、迅速診断検査室に臨床翻訳のためのバイオマーカーを評価し、検証するために使用することができる1つの方法であります。伝統的に、このプラットフォームは、臨床検査室での小分子の測定に広く使用されてきたが、それはそれをELISA（酵素結合Immunosorに魅力的な代替を行い、タンパク質を分析するための電位であります曲がったアッセイ）メソッドをベース。我々は、Eアイソフォーム4（のApoE4）のアポリポタンパク質既知の危険因子の検出および定量を含む認知症の多重マーカーを測定するために使用できる方法ターゲットプロテオミクスここに記載しています。 翻訳のための適切なアッセイを行うためには、有効な高度に特異的かつコスト、迅速簡単になるように設計されています。これを達成するために、アッセイの開発におけるすべてのステップは、彼らがで分析されている個々のタンパク質や組織のために最適化されなければならない。この方法は、翻訳の対象とプロテオミクスMRMのLC-MS / MSを開発する様々なヒントやトリックなどの一般的なワークフローについて説明します。 メソッド開発は、検出のためのMSのキャリブレーションをトリプシンquantotypicペプチドのカスタム合成バージョンを使用して最適化した後、MSにおける分析の前にクロマトグラフ分離における内因性ペプチドの正確な同定を決定するために、CSFにスパイクされています。 absoluを達成するためにTE定量、短いアミノ酸配列タグを有するペプチドの安定同位体標識内部標準バージョンおよびトリプシン切断部位を含むが、アッセイに含まれています。

上述の方法を用いて、54のタンパク質からの74ペプチドからなるハイスループット10分間多重アッセイは、神経変性疾患、アルツハイマー病およびレビー小体型認知症（LBD）8。 図3のマーカーのためのアッセイとして、開発された、公開多重クロマトグラムを示します以前アッセイからの重要なペプチドマーカーの8。ペプチドは、アッセイ...

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A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

リモートハイスループット表現型解析のためのマウスの目の摘出

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

神経変性疾患におけるハイコンテントスクリーニング

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

急性移植片対宿主病のバイオマーカーの検証のためのハイスループットシーケンシャルELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

アポ E 欠損マウスにおける鉱質コルチコイド受容体の活性化を介して動脈硬化性プラークの誘導

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...