Name: a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00
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This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer's Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer's Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

참고 :. 여기에 설명 된 전체 프로토콜의 개략적 인이 Fi를 gure 1에 제시되어이 방법의 개발에 사용 된 모든 샘플은 흑자 임상 진단 샘플이며 런던 블룸 스 버리 윤리위원회의 윤리 승인을 가지고있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig1.jpg" /> 평가를 위해 타겟팅 된 CSF의 MRM LC-MS / MS 분석. 후보 표지자...

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	<li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).</li><li>Hirtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+new+quantitative+mass+spectrometry+and+semi-automatic+isofocusing+methods+for+the+determination+of+Apolipoprotein+E+typing.">Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing.</a> Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics.">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).</li><li>Heywood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+peptide+SRM-based+tandem+mass+spectrometry+assay+for+prenatal+screening+of+Down+syndrome.">The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome.</a> J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).</li><li>Heywood, W. 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모든 MS 기반 분석에서와 같이, 상기 방법에서 중요한 단계는 내부 표준 물질의 적정하고 정확한 양의 측정이다. 절대 정량이 사용되는 경우, 표준 곡선 아군 펩티드의 정확한 양 또한 중요하다. 우리의 분석은 CSF 또는 종래 MS 분석에 정리하거나 탈염 같이 임의의 유형의 사용의 석출을 필요로하지 않는 - 그것은 전적으로 한 냄비 반응 방법이다. 인해 CSF의 작은 부피와 한정?...

알츠하이머 병, 루이체 치매 및 파킨슨 질환과 같은 신경 퇴행성 질환의 증가 효과는 많은 국가 하나의 사회 경제적 문제가되고있다. 식별 및 질병의 초기 단계에 환자를 분류하고, 잠재적 인 새로운 치료를 모니터링하는데 사용될 수있는 추가의 바이오 마커가 필요하다. 이 방법의 전반적인 목표는 신경 퇴행의 가능성 CSF 마커의 유효성을 검사하는 간소화 된 경제 및 빠른 방법에 대한 일반적인 파이프 라인을 만드는 것입니다. 이론적 디스커버리 실험에서 여러 잠재적 바이오 마커 단백질을 평가하기 쉽게 수정할 수있는 방법으로 타겟 프로테오믹스 또는 펩티드 MRM LC-MS / MS를 사용하는 것이다. 이러한 더 빠른 크로마토 그래피 분리 (&lt;10 분) 및 평가를 통해 다중화 될 수있다. 신경 퇴행성 바이오 마커이 다중 화면 내에서, 우리는 알려진 치매 위험 인자의 아포지 단백질 이소 E4 (ApoE4로)를 포함했다 그래서 우리는 캘리포니아N이 별개의 유전자형이 테스트에 대한 필요성을 제거함으로써 동시에 그 상태 발현 수준을 결정한다. LC MS / MS 일상적 정확하게 예컨대 ELISA 또는 방사선 면역 측정법 (RIA) 등의 다른 방법보다 작은 분자를 정량 선호하는 방법으로 사용된다. 분석 단백질 MS 기술의 사용이 시프트는 면역 기반 기술의 문제에 의해 주로 구동되었다. 이러한 교차 특이도, 일괄 배치 변화에 제한된 수명, 높은 비용을 포함한다. 따라서, 표적 단백질 체학은 급속 같은 웨스턴 블로 팅, RIA와 ELISA로 항체 기반의 방법에 성장 대안이되고있다. 그러나, 하나의 분석에 많은 마커를 다중화 할 수있는 능력은 면역 기반 방법 (3)을 통해이 기술의 중요한 이점이다. 이 기술은 많은 조직에 적용 할 수 있으며, 플라즈마 (4) 및 소변 5,6- 포함한 많은 프로테오믹스 연구 검증 전략으로 사용되어왔다. 테chnique는 삼중 사중 극 질량 분석기를 사용하여에 액세스 및 전문성이있는 기관에 적용 할 수 있습니다. 펩타이드 디자인은 오픈 소스 데이터베이스의 사용 증가와 상대적으로 간단하다. 사용자 정의 펩타이드 합성의 경쟁 시장은 그들이 훨씬 더 저렴합니다. 무거운 펩티드 그러나, 고가이며, 따라서 표지가 대규모로 이동하기 전에 작은 집단에 평가되어야한다. 기술이 가장 큰 병원 쉽게 타겟팅 프로테옴 분석을 실행하도록 구성 될 수있는 삼중 사중 기반 플랫폼을 갖는 임상 진단 세팅에서 사용하는 성장 가능성이있다. 방법의 하나는 이러한 응용 프로그램, 루틴 진단 설정으로 제작, 겸상 적혈구 빈혈 7 신생아 혈액 현장 심사에 최근 응용 프로그램입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetonitrile (ACN), LC-MS grade&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A955-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid, LC-MS grade,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D5545-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BDH3028-2.5LG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">I1149-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water, LC-MS ULTRA Chromasolv</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14263</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Custom synthesised peptides desalted 1-4mg</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">ASB 14</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">182750-25gm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Thiourea</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7875-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6066</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">VanGuard precolumn</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Cortecs UPLC C18+ 1.6um&#160; 2.1 x50mm column</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Yeast Enolase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6126</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">300ul clear screw top glass vials&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-FISV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Y slit screw caps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">9SCK-(B)-ST1X</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:71px;">Edwards Mudulyo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Mudulyo system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Concentrator/Speed vaccum</td>
			<td style="width:71px;">Eppendof&#160;</td>
			<td style="width:119px;">concentrator&#160; plus 5301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Xevo -TQ-S mass spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status

많은 신경 퇴행성 질환은 여전히 효과적인 치료법이 결여되어있다. 식별하고 이러한 질병을 분류하기위한 신뢰할 수있는 바이오 마커는 미래의 새로운 치료법의 개발에 중요하다. 종종 잠재적 인 새로운 바이오 마커는 그들의 개발과 높은 비용의 한계로 병원으로하지 않습니다. 그러나, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 모니터링 다양한 반응을 이용하여 표적 단백질 체학은 / 질량 분석 즉, 삼중 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 (MRM 된 LC-MS / MS)를 빠르게 진단 실험실로 임상 번역 바이오 마커를 평가하고 검증하는 데 사용될 수있는 하나의 방법이다 . 전통적으로,이 플랫폼은 임상 실험실에서 작은 분자의 측정에 광범위하게 사용되고 있지만, 그것은 그것을 ELISA (효소 결합 Immunosor에 매력적인 대안을 만드는 단백질을 분석 할 수있는 잠재적 인굴곡 량 법) 방법을 기반. 우리는 E 이성체 4 (ApoE4로)를 아포지 단백질 공지 된 위험 인자의 검출 및 정량화를 포함한 치매 다중화 마커를 측정하는 방법을 프로테오믹스 타겟 여기서 설명한다. 번역 분석에 적합하게하기 위하여, 신속한 간단한 매우 특정하고 비용 효율적인 설계된다. 이를 달성하기 위해, 분석법 개발의 모든 단계들이 분석되어 각각의 단백질과 조직에 대해 최적화되어야한다.이 방법은 번역 타겟 프로테오믹스 MRM 된 LC-MS / MS를 개발하는 다양한 팁과 포함하는 일반적인 흐름을 설명 . 방법 개발 검출을위한 MS를 보정 트립신 quantotypic 펩티드의 사용자 지정 합성 버전을 사용하여 최적화 한 다음 이전에 MS의 분석 크로마토 그래피 분리에 내인성 펩티드의 정확한 식별을 결정하기 위해 CSF로 급증한다. 압솔뤼을 달성하기 위해TE 정량 짧은 아미노산 서열 태그에 트립신 절단 부위를 포함하는 펩티드와 안정 동위체 표지 내부 표준 버전은, 상기 분석에 포함된다.

전술 한 방법을 사용하여, 54 단백질 74 펩티드로 이루어진 높은 처리량을 10 분 다중 분석이 신경 퇴행성 질환 알츠하이머 병 및 루이체 치매 (LBD) (8).도 3의 마커에 대한 분석으로 개발되었다 게시 다중화 크로마토 그램이다 이전에 8 분석에서 중요한 펩타이드 마커. 분석 및 정량 전이에 포함 된 펩티드. 표 2에 주어진이 방법에 의?...

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A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

우리는 임상 번역 잠재력 개발 된 높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 뇌척수액 (CSF) 분석에 대해 설명합니다. 시험은 예컨대 아포지 단백질 E 변형 (E2, E3 및 E4)과 같은 신경 퇴행에 대한 잠재적 마커 및 위험 인자를 정량하고, 그 대립 유전자 발현을 측정 할 수있다.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

연구

의학

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

급성 이식 - 대 - 호스트 질병의 생체의 유효성을 검사에 대한 높은 처리량 순차적 엘리사

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Apolipoprotein E-불충분 한 쥐에 Mineralocorticoid 수용 체의 활성화를 통해 동맥 경 화성 플 라크의 유도

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...