Name: a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status at JoVE.com

This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer's Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer's Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

Примечание:. Схема общего протокола , описанного здесь дается в рисунке 1 Все образцы , используемые для разработки этого метода являются избыточные клинические диагностические пробы и имеют этическое одобрение от комитета по этике London Bloomsbury. <...

<ol>
	<li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).</li><li>Hirtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+new+quantitative+mass+spectrometry+and+semi-automatic+isofocusing+methods+for+the+determination+of+Apolipoprotein+E+typing.">Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing.</a> Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics.">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).</li><li>Heywood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+peptide+SRM-based+tandem+mass+spectrometry+assay+for+prenatal+screening+of+Down+syndrome.">The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome.</a> J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).</li><li>Heywood, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Discovery+and+Development+of+a+Multiplexed+Targeted+MRM-LC-MS/MS+Assay+for+Urine+Biomarkers+of+Extracellular+Matrix+Disruption+in+Mucopolysaccharidoses+I,+II,+and+VI.">Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI.</a> Anal Chem. , (2015).</li><li>Manwaring, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+new+biomarkers+for+identifying+and+monitoring+kidney+disease+and+their+translation+into+a+rapid+mass+spectrometry-based+test:+evidence+of+presymptomatic+kidney+disease+in+pediatric+Fabry+and+type-I+diabetic+patients.">The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients.</a> J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).</li><li>Moat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+blood+spot+screening+for+sickle+cell+disease+by+using+tandem+mass+spectrometry:+implementation+of+a+protocol+to+identify+only+the+disease+states+of+sickle+cell+disease.">Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease.</a> Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).</li><li>Heywood, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+CSF+biomarkers+for+neurodegeneration+and+their+validation+by+a+high-throughput+multiplexed+targeted+proteomic+assay.">Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay.</a> Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+Reaction+Monitoring+Mass+Spectrometry+for+Absolute+Protein+Quantification.">Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification.</a> J Vis Exp. (102), e52959 (2015).</li><li>Craig-Schapiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YKL-40:+a+novel+prognostic+fluid+biomarker+for+preclinical+Alzheimer's+disease.">YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease.</a> Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).</li><li>Perrin, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+novel+cerebrospinal+fluid+biomarkers+for+staging+early+Alzheimer's+disease.">Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).</li><li>Liguori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexinergic+system+dysregulation,+sleep+impairment,+and+cognitive+decline+in+Alzheimer+disease.">Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease.</a> JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).</li></ol>

Как и со всеми на основе MS анализов, критические шаги в методе являются определение соответствующих и точных сумм внутренних стандартов. Если абсолютное Количественное определение используется, то правильные количества меченых пептидов в стандартной кривой также имеют важное значен...

Растущее влияние нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера, деменция с тельцами Леви и болезнь Паркинсона, становится социально - экономической проблемой во многих странах 1. Существует потребность в дополнительных биомаркеров, которые могут быть использованы для идентификации и классификации пациентов на ранних стадиях заболевания, а также для мониторинга любых потенциальных новых методов лечения. Общая цель этого метода заключается в создании общего трубопровода для обтекаемой, экономичным и быстрым способом проверки потенциальных маркеров CSF нейродегенерации. Смысл заключается в использовании целевых протеомики или пептида MRM LC-MS / MS, как легко исправимо метод для оценки множества потенциальных биомаркеров белка из экспериментов обнаружения. Они могут быть далее мультиплексированы более быстрым хроматографическим разделением (&lt;10 мин) и оценены. В пределах этого мультиплекса экрана для нейродегенеративных биомаркеров, мы включили известный фактор риска развития слабоумия аполипопротеина E4 изоформы (apoE4), поэтому мы чап одновременно определить его статус и уровень экспрессии, тем самым устраняя необходимость в отдельных тестах генотипирования 2. LC-MS / MS обычно используется в качестве метода выбора для точного количественного анализа малых молекул, по сравнению с другими методами, такими как ELISA или иммунологического анализа (RIA). Этот сдвиг в использовании технологии MS для анализа белков, было обусловлено в основном проблемами с иммуно-технологии. Они включают в себя кросс-специфичность, от партии к партии изменения, ограниченный срок годности, а также высокую стоимость. Поэтому целенаправленные протеомика быстро становится растущей альтернативой методам антител на основе таких как Вестерн-блоттинга, RIA и ELISA. Тем не менее, способность мультиплексировать множество маркеров в одном анализе является основным преимуществом этого метода над иммуно на основе методов 3. Методика применима ко многим тканям и использовалась в качестве стратегии аттестации для многих протеомики исследований , включая плазму 4 и мочи 5,6. тэchnique может быть применен к любой лаборатории, которая имеет доступ и опыт в использовании тройные квадрупольные масс-спектрометры. Конструкция Пептид является относительно простым с растущим использованием баз данных с открытым исходным кодом. Конкурентный рынок синтеза пептидов пользовательских делает их гораздо более доступными. Тяжелые пептиды, однако, являются дорогостоящими и поэтому маркеры должны быть оценены на небольшой когорте до переезда в более крупном масштабе. Существует растущий потенциал для техники для использования в клинических диагностических параметрах, при этом большинство крупных больниц, имеющих тройные платформы на базе квадрупольные, которые могут быть легко адаптированы для выполнения целевых протеомические анализов. Одним из таких применений метода, что делает его в рутинной диагностической установке, является его недавнее применение к скрининга новорожденных пятна крови на серповидно - клеточная анемия 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetonitrile (ACN), LC-MS grade&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A955-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid, LC-MS grade,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D5545-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BDH3028-2.5LG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">I1149-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water, LC-MS ULTRA Chromasolv</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14263</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Custom synthesised peptides desalted 1-4mg</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">ASB 14</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">182750-25gm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Thiourea</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7875-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6066</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">VanGuard precolumn</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Cortecs UPLC C18+ 1.6um&#160; 2.1 x50mm column</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Yeast Enolase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6126</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">300ul clear screw top glass vials&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-FISV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Y slit screw caps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">9SCK-(B)-ST1X</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:71px;">Edwards Mudulyo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Mudulyo system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Concentrator/Speed vaccum</td>
			<td style="width:71px;">Eppendof&#160;</td>
			<td style="width:119px;">concentrator&#160; plus 5301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Xevo -TQ-S mass spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status

Многие нейродегенеративные заболевания , до сих пор отсутствуют эффективные методы лечения. Надежные биомаркеры для идентификации и классификации этих заболеваний будет иметь важное значение в развитии будущих новых видов лечения. Часто потенциальные новые биомаркеры не делают его в клинику из-за ограничений в их развитии и высокими затратами. Тем не менее, целевые протеомики с использованием множественного контролировании реакции жидкостной хроматографии-тандем / масс-спектрометрии (МРМ ЖХ-МС / МС), в частности, с помощью тройных квадрупольные масс-спектрометры, является одним из методов, который может быть использован для быстрой оценки и подтверждения биомаркеров для клинического перевода в диагностические лаборатории , Традиционно, эта платформа широко используется для измерения малых молекул в клинических лабораториях, но потенциал для анализа белков, что делает его привлекательной альтернативой ELISA (Enzyme-Linked Immunosorсогнуты анализа) основе методов. Здесь мы опишем, как целенаправленный протеомики могут быть использованы для измерения уплотненных маркеров деменции, в том числе детекции и количественного определения известного фактора риска алипопротеина изоформы 4 (apoE4). Для того чтобы сделать анализ подходит для перевода, он предназначен, чтобы быть быстрым, простым, высокоспецифичным и экономически эффективным. Для достижения этой цели, каждый шаг в развитии анализа должны быть оптимизированы для отдельных белков и тканей они анализируются. Этот метод описывает типичный рабочий процесс, включая различные советы и приемы для разработки целевых протеомика MRM LC-MS / MS для перевода , Разработка метода оптимизирована с использованием пользовательских синтезированные версии триптических quantotypic пептидов, которые откалибровать MS для обнаружения, а затем подскочили в CSF, чтобы определить правильную идентификацию эндогенного пептида в хроматографического разделения до анализа в MS. Для достижения ABSOLUТ.Е. Количественную, стабильные меченого изотопом внутренний стандарт версии пептидов с бирками порядковых кислоты коротким амино- и содержащий сайт расщепления трипсином, включены в анализ.

С помощью метода , описанного выше, был разработан с высокой пропускной способностью 10 мин мультиплексного анализа , состоящий из 74 пептидов из 54 белков, как тест на маркеры нейродегенеративных расстройств болезни Альцгеймера и деменции с тельцами Леви (LBD) 8. На <s...

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status at JoVE.com

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Мы описываем высокой пропускной способностью, мультиплекс, и целевой Протеомные спинномозговой жидкости (CSF) анализ, разработанный с потенциалом для клинического перевода. Тест может количественно оценить потенциальные маркеры и факторы риска для нейродегенеративных, такие как варианты гена аполипопротеина Е (Е2, Е3 и Е4), и измерить их аллельного выражение.

Высокая пропускная способность, Multiplexed и Targeted Протеомный CSF Анализ на Количественно нейродегенеративных биомаркеров и аполипопротеина Е изоформы Статус

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Мышь глаз Энуклеация для удаленного высокой пропускной Фенотипирование

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Биомаркеры в животной модели для выявления нервных, гематологических, и поведенческие корреляты посттравматического стрессового расстройства

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Высокая Скрининг Содержание в нейродегенеративных заболеваний

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Высокая пропускная способность последовательного ELISA для проверки биомаркеров острого трансплантат против хозяина

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Высокая пропускная способность Характеристика взрослых стволовых клеток разработан для доставки терапевтических факторов для Нейропротекторное стратегий

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Оптимизированный Hemagglutination Assay ингибирование (HI) поддается гриппа специфические антитела титры

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Индукция атеросклеротических бляшек через активацию рецепторов минералокортикоиды аполипопротеин E-недостаточным мышей

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Nitrobenzoxadiazole меченых холестерина высокой пропускной способности измеряем Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

Улучшенная и высокой пропускной способности Assay микро нейтрализация респираторно-синцитиальный вирус (RSV)

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...