Name: a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status at JoVE.com

This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer's Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer's Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

OBS:. Ett schema över den totala Protokollet som beskrivs här ges i Fi gur 1 Alla prover som används för utvecklingen av denna metod utgör överskotts kliniska diagnostiska prover och har etiskt godkännande från London Bloomsbury etikkommittén. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk illustrerar den övergripande processen för att skapa en riktad CSF MRM LC-M...

<ol>
	<li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).</li><li>Hirtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+new+quantitative+mass+spectrometry+and+semi-automatic+isofocusing+methods+for+the+determination+of+Apolipoprotein+E+typing.">Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing.</a> Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics.">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).</li><li>Heywood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+peptide+SRM-based+tandem+mass+spectrometry+assay+for+prenatal+screening+of+Down+syndrome.">The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome.</a> J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).</li><li>Heywood, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Discovery+and+Development+of+a+Multiplexed+Targeted+MRM-LC-MS/MS+Assay+for+Urine+Biomarkers+of+Extracellular+Matrix+Disruption+in+Mucopolysaccharidoses+I,+II,+and+VI.">Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI.</a> Anal Chem. , (2015).</li><li>Manwaring, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+new+biomarkers+for+identifying+and+monitoring+kidney+disease+and+their+translation+into+a+rapid+mass+spectrometry-based+test:+evidence+of+presymptomatic+kidney+disease+in+pediatric+Fabry+and+type-I+diabetic+patients.">The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients.</a> J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).</li><li>Moat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+blood+spot+screening+for+sickle+cell+disease+by+using+tandem+mass+spectrometry:+implementation+of+a+protocol+to+identify+only+the+disease+states+of+sickle+cell+disease.">Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease.</a> Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).</li><li>Heywood, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+CSF+biomarkers+for+neurodegeneration+and+their+validation+by+a+high-throughput+multiplexed+targeted+proteomic+assay.">Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay.</a> Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+Reaction+Monitoring+Mass+Spectrometry+for+Absolute+Protein+Quantification.">Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification.</a> J Vis Exp. (102), e52959 (2015).</li><li>Craig-Schapiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YKL-40:+a+novel+prognostic+fluid+biomarker+for+preclinical+Alzheimer's+disease.">YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease.</a> Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).</li><li>Perrin, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+novel+cerebrospinal+fluid+biomarkers+for+staging+early+Alzheimer's+disease.">Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).</li><li>Liguori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexinergic+system+dysregulation,+sleep+impairment,+and+cognitive+decline+in+Alzheimer+disease.">Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease.</a> JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).</li></ol>

Som med alla MS baserade analyser, de kritiska stegen i förfarandet är att fastställa de lämpliga och exakta mängder av inre standarder. Om absolut kvantifiering används, då de rätta mängderna av spetsade peptider i standardkurvan är också kritisk. Vår analys kräver inte utfällningen av CSF eller användning av någon typ av rena upp eller avsaltningssteg före MS-analys - det är en helt enkärlsreaktion metod. På grund av den lilla volymen av CSF och dess begränsade komplex...

Fördjupning av neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom, Lewy body demens och Parkinsons sjukdom, blir en samhällsekonomisk fråga i många länder 1. Det finns ett behov i ytterligare biomarkörer som kan användas för att identifiera och klassificera patienter i ett tidigt skede av sjukdomen, och att övervaka eventuella nya behandlingar. Det övergripande målet med denna metod är att skapa en generisk rörledning för en strömlinjeformad, ekonomisk och snabbare sätt att validera potentiella CSF markörer för neurodegeneration. Skälet är att använda riktade proteomik eller peptid MRM LC-MS / MS som en lätt kan ändras metod för att bedöma flera potentiella protein biomarkörer från upptäckt experiment. Dessa kan vidare multiplexeras över en snabb kromatografisk separation (&lt;10 min) och bedömas. Inom denna multiplex skärm för neurodegenerativa biomarkörer har vi inkluderat den kända demensriskfaktorn apolipoprotein isoform E4 (ApoE4) så vi can bestämma samtidigt sin status och uttryck av att eliminera behovet av separata gentypningstester 2. LC MS / MS används rutinmässigt som den viktigaste metoden för exakt kvantifiering av små molekyler jämfört med andra metoder, såsom ELISA eller radioimmunanalys (RIA). Denna förskjutning i användningen av MS-teknik för att analysera proteiner, har drivits främst av problem med de immuno-baserade teknologier. Dessa innefattar tvär specificitet, variation mellan tillverkningspartier, begränsad hållbarhet och höga kostnader. Därför riktade proteomik snabbt på att bli en växande alternativ till antikroppsbaserade metoder såsom Western blotting, RIA och ELISA. Emellertid är förmågan att multiplexa flera markörer i en analys den största fördelen med denna teknik under immuno-baserade metoder 3. Tekniken kan tillämpas på många vävnader och har använts som en valideringsstrategi för många proteomikstudier inklusive plasma 4 och urin 5,6. den technique kan tillämpas på alla laboratorier som har tillgång och expertis i att använda trippelkvadrupolmasspektrometer masspektrometrar. Peptid design är relativt enkelt med den ökande användningen av öppen källkod databaser. Den konkurrensutsatta marknaden anpassade peptider syntes gör dem mycket mer prisvärd. Tunga peptider är emellertid dyr och därför markörerna bör bedömas på en liten kohort innan han flyttade till en större skala. Det finns en växande potential för tekniken som ska användas i de kliniska diagnostiska inställningar, med de flesta stora sjukhus har trippelkvadrupol baserade plattformar som lätt kan anpassas för att köra riktade proteomik analyser. En sådan tillämpning av metoden, vilket gör det in i rutinmässig diagnostisk miljö, är dess tillämpning på senare tid till nyfödda blod plats screening för sicklecellanemi 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acetonitrile (ACN), LC-MS grade&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A955-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid, LC-MS grade,</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A117-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D5545-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid, 37% w/w</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BDH3028-2.5LG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">I1149-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, sequencing grade, modified</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A116-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0631-500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water, LC-MS ULTRA Chromasolv</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14263</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Custom synthesised peptides desalted 1-4mg</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides</td>
			<td style="width:71px;">Genscript</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">ASB 14</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">182750-25gm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Thiourea</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7875-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6066</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">VanGuard precolumn</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Cortecs UPLC C18+ 1.6um&#160; 2.1 x50mm column</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186007114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Yeast Enolase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6126</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">300ul clear screw top glass vials&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-FISV</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Y slit screw caps&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">9SCK-(B)-ST1X</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:71px;">Edwards Mudulyo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Mudulyo system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:352px;">Concentrator/Speed vaccum</td>
			<td style="width:71px;">Eppendof&#160;</td>
			<td style="width:119px;">concentrator&#160; plus 5301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Xevo -TQ-S mass spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:71px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput, multiplexed and targeted proteomic csf assay to quantify neurodegenerative biomarkers and apolipoprotein e isoforms status

Många neurodegenerativa sjukdomar fortfarande saknar effektiva behandlingar. Tillförlitliga biomarkörer för att identifiera och klassificera dessa sjukdomar kommer att vara viktiga i utvecklingen av framtidens nya terapier. Ofta potentiella nya biomarkörer inte gör det i kliniken på grund av begränsningar i deras utveckling och höga kostnader. Men riktade proteomik använder flera Reaction Monitoring vätskekromatografi-tandem / masspektrometri (MRM LC-MS / MS), särskilt med hjälp av trippelkvadrupol masspektrometrar, är en metod som kan användas för att snabbt bedöma och värdera biomarkörer för klinisk översättning till diagnostiklaboratorier . Traditionellt har denna plattform använts i stor omfattning för mätning av små molekyler i kliniska laboratorier, men det finns risk för att analysera proteiner, som gör den till ett attraktivt alternativ till ELISA (Enzyme-Linked Immunosorböjd Assay) -baserade metoder. Vi beskriver här hur riktade proteomik kan användas för att mäta multiplexerade markörer av demens, inklusive detektering och kvantifiering av känd riskfaktor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4). För att göra analysen lämplig för översättning, är det avsett att vara en snabb, enkel, mycket specifika och kostnadseffektiv. För att uppnå detta måste varje steg i utvecklingen av analysen optimeras för de enskilda proteiner och vävnader de analyseras i. Denna metod beskriver en typisk arbetsflöde inklusive olika tips och tricks för att utveckla en riktad proteomik MRM LC-MS / MS för översättning . Metodutveckling optimeras med hjälp av anpassade syntetiserade versioner av tryptiska quantotypic peptider, som kalibrera MS för detektering och sedan spetsade i CSF för att fastställa korrekt identifiering av den endogena peptiden i den kromatografiska separationen före analysen i MS. Att uppnå absolute kvantifiering, stabila isotopmärkta interna standardversioner av de peptider med korta aminosyrasekvenstaggar och innehållande en trypsin-klyvningsstället, ingår i analysen.

Användning av förfarandet beskrivet ovan, en hög genomströmning 10 min multiplex assay bestående av 74 peptider från 54-proteiner utvecklats, som en analys för markörer av de neurodegenerativa störningar Alzheimers sjukdom och Lewykropp-demens (LBD) 8. Figur 3 visar en multiplex kromatogram publicerad tidigare åtta av de betydande peptidmarkörer från analysen. Peptiderna som ingår i analysen och deras kvantitativa övergångar ges i <st...

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status at JoVE.com

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Vi beskriver en hög genomströmning, multiplex, och riktade proteomik cerebrospinalvätska (CSF) analys utvecklad med potential för klinisk översättning. Testet kan kvantifiera potentiella markörer och riskfaktorer för neurodegeneration, såsom apolipoprotein E varianterna (E2, E3 och E4), och mäta deras alleliska uttryck.

En hög genomströmning, Multiplex och riktade proteomik CSF analys för att kvantifiera neurodegenerativa Biomarkers och apolipoprotein E isoformer Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Mus Eye enucleation för Remote hög kapacitet Fenotypning

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Hög halt Screening vid neurodegenerativa sjukdomar

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Hög genomströmning Sekventiell ELISA för validering av biomarkörer för akut graft-versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Hög genomströmning karakterisering av vuxna stamceller Engineered för leverans av terapeutiska faktorer för Nervskyddande Strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

En optimerad Hemagglutination hämning (HI) analys att kvantifiera influensa-specifik antikropp titrar

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Induktion av aterosklerotiska plack genom aktivering av mineralkortikoida receptorer i Apolipoprotein E-brist möss

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-märkt kolesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

En förbättrad och hög genomströmning Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...