Name: antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads
Uploaded: 2016-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads at JoVE.com

1. Antikörper-Capture auf High Capacity Magnetic Protein A oder Protein G Magnetic Beads <ol><li> Einheitlich resuspendieren magnetische Kügelchen durch leichtes Schütteln. Halten Sie die Suspension gleichmäßig, wenn Aliquotierung Perlen. </li><li> Je 50 ul Kügelchenaufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Sie vorsichtig den Speicherpuffer zu entfernen. </li><li> In 250 ul Antikörper-Bindungspuffer. </li><li> Mischen Sie und legen Sie in de...

<ol>
	<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome.">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li><li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeled+antigens+and+antibodies:+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets.">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li><li>Day, J. 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Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zu entwickeln, Antikörper, die in dem Zellmedium in geringen Konzentrationen, mit einer Vielzahl von kleinen Molekülen zu markieren. Ein derartiges Verfahren, eine große Anzahl von Antikörpern, während der frühen Phasen der Antikörper Entdeckung ermöglicht, mit kleinen Molekülen und gesiebt unter Verwendung eines biologisch relevanten Test gekennzeichnet werden. Ein solcher Assay ist der Rezeptor-vermittelten Internalisierung Antikörper Assay wo Internalisierung zwi...

Antikörper , markiert mit kleinen Molekülen sind vielleicht die am häufigsten verwendeten Reagenzien in der Biologie 1,2. Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte und Biotin werden in großem Umfang in der Bildgebung, Immunoassays, Durchflusszytometrie, Western - Blots und Immunpräzipitation unter anderen Anwendungen 3-6. Radioaktiv markierte Antikörper 3,7 finden umfangreiche Verwendung in der Bildgebung und Therapie, markierte Antikörper mit Zytostatika (ADCs) bieten neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krebs und zwei ADCs wurden bereits für den therapeutischen Einsatz 8 genehmigt. Trotz einer umfassenden Nutzung haben sich die Verfahren zur Markierung von Antikörpern blieb überraschenderweise unverändert und beinhalten typischerweise mehrere Reaktionen und Entsalzung Schritte 9-12. Lösungsmethoden arbeiten sehr gut in Fällen, in denen nur wenige Antikörper müssen gekennzeichnet werden und in gereinigter Form zur Verfügung stehen hoch in hoher Konzentration und in ausreichender Menge. Jedoch für neuere Anwendungen wie ADCs gibt es einAntikörper müssen in der frühen Stufe Hybridom zu etikettieren , so dass sie für biologisch relevante Eigenschaften gescreent werden, beispielsweise rezeptorvermittelte Internalisierung Antikörper 13-16. Bei dem Hybridom Stadium sind Probenvolumina begrenzt, Antikörper werden in niedrigen Konzentrationen exprimiert und eine Anzahl von Proben sind groß, daher Lösung auf Basis Markierungsmethoden sind nicht geeignet. Zur Vereinfachung und den Durchsatz der traditionellen Antikörpermarkierung Methoden zu verbessern, einige alternative Ansätze wurden 17,18 vorgeschlagen. Ein Ansatz ist es nicht magnetischen Protein-A-Affinitätskügelchen in kleine Säulen gepackt zu verwenden, um Antikörper, gefolgt von der Markierungsreaktion und Elution von markiertem und gereinigtem Protein erfassen. Dieses Verfahren verwendet werden, die Antikörper direkt aus Zellmedien zu beschriften, jedoch kann die Verwendung von Säulen umständlich sein. Ein magnetisches bead basierte Methode wurde kürzlich berichtet worden , 19 daß die Verwendung von Spalten eliminiert und verbessert den Durchsatz , aber wegender begrenzten Antikörperkapazität der Beads Bindung nur Nanogramm bis niedrigen Mikrogramm-Mengen der Antikörper markiert werden. Wir haben vor kurzem entwickelt und verwendet hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G - Kügelchen (&gt; 20 mg Human - IgG / ml des abgesetzten Kügelchen) 20 - Antikörpern in Zellmedien mit kleinen Molekülen zu markieren. Die hohe Kapazität der Kügelchen ermöglicht zehn bis hundert Mikrogramm Antikörper bequem gekennzeichnet werden und die schnelle magnetische Reaktion der Kügelchen vereinfacht die Handhabung und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben in parallel. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als Surrogate für kleine Moleküle zeigen wir, dass das Verfahren mit dem Amin und Thiol Markierungschemie kompatibel und bietet eine hohe Gewinnungsraten von markierten und sehr reine Antikörper. Dieses Protokoll und die zugehörigen Video beschreiben On-Bead-Kennzeichnung von Maus-Antikörper, die in den Zellmedien Magnetic Protein A und Protein G-Kügelchen verwendet wird. Das Protokoll istgliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 1 beschreibt die Erfassung von Antikörpern auf den Wulst aus biologischen Proben. Nach Erfassung der Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoff Aminchemie oder Thiolchemie verwendet, ist in den Abschnitten 2 und Abschnitt 3 beschrieben sind. Schließlich Abschnitt 4 beschreibt das Verfahren zur Berechnung der Antikörperkonzentration und der Farbstoff-Antikörper-Verhältnis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="592">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein A Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G8781</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein G Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescein-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

Antikörper, markiert mit kleinen Molekülen, wie fluoreszierende Farbstoffe, Zytostatika, und radioaktive Tracer sind wesentliche Instrumente in der biomedizinischen Forschung, der Immundiagnostik und in jüngerer Zeit als therapeutische Wirkstoffe. Herkömmliche Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit kleinen Molekülen erfordern Antikörper in relativ hoher Konzentration, beinhalten mehrere Dialyseschritte gereinigt und haben eine begrenzte Durchsatz. Jedoch mehrere Anwendungen, einschließlich dem Gebiet der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), werden von den neuen Methoden profitieren, die Markierung von Antikörpern direkt von Zellmedien ermöglicht. in biologisch relevanten Assays gescreent werden, beispielsweise der Rezeptor-vermittelten Internalisierung Antikörper-Assay im Falle von ADCs Solche Verfahren können Antikörper ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Verfahren (on-bead-Methode), die Etikettierung von kleinen Mengen von Antikörpern direkt aus Zellmedien ermöglicht. Dieser Ansatz nutzt hohe Kapazität magnetischen Protein A und Protein G Affinitätsbeads Antikörper zu erfassenaus den Zellmedien durch Markierung mit kleinen Molekülen, gefolgt entweder Amin- oder Thiol-Chemie und anschließende Elution der markierten Antikörper verwendet. Unter Fluoreszenzfarbstoffe als Surrogate für kleine Moleküle, zeigen wir die On-Bead-Kennzeichnung von drei verschiedenen Maus-Antikörper direkt aus Zellmedien sowohl Amin und Thiol Markierungschemie verwendet wird. Die hohe Bindungsaffinität von Antikörpern an Protein A und Protein G sorgt für eine hohe Wiederfindungsraten sowie hoher Reinheit der markierten Antikörper. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von magnetischen Kügelchen mehrere Proben manuell, wodurch deutlich Kennzeichnungs Durchsatz verbessert behandelt werden.

Eine schematische für Antikörper mit kleinen Molekülen unter Verwendung von hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G - Kügelchen Kennzeichnung ist in Abbildung 1 dargestellt. Antibodies auf dem magnetischen Protein G - Kügelchen eingefangen kann mit kleinen Molekülen markiert werden, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, entweder Aminchemie , die Etiketten primäre Amine der Lysin Aminosäuren oder unter Verwendung von Thiol-Chemie, die bei den reduzie...

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Die on-bead-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern mit kleinen Molekülen Kennzeichnung ermöglicht die Kennzeichnung von einer geringen Menge an Antikörper direkt aus Zellmedien. Dieses Verfahren ist kompatibel mit Amin und Thiolchemie und kann mehrere Proben parallel, manuell oder mit automatisierten Systemen verarbeiten.

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

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