Name: the use of induced somatic sector analysis (issa) for studying genes and promoters involved in wood formation and secondary stem development
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development at JoVE.com

The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.

1. Beredning av växtmaterial <ol><li> Före experiment, ta upp nya plantor av de föredragna trädslag från frö eller styckning och växa träd / s tills stammens diameter i området avsett för experiment är ca 1 cm i diameter. Obs: Tidsåtgången kan variera beroende på växttillväxttakt tillåter därför mellan tre till nio månader för detta steg. </li></ol> 2. Binär vektor Creation <ol><li> Genomföra arbete från detta avsnitt till avsnitt 7 i ett laboratorium eller väx...

<ol>
	<li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations.">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li><li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood+formation+in+forest+trees:+from+Arabidopsis+to+Zinnia.">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li><li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation,+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don.">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li><li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts.">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li><li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eucalyptus+hairy+roots,+a+fast,+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation.">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li><li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+(ISSA)+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species.">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li><li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues.">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li><li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls.">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li><li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics.">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li><li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+(CesA)+promoter+regions+in+woody+stem+tissues.">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li><li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SND2,+a+NAC+transcription+factor+gene,+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus.">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li><li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+(ISSA)+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems.">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li><li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PtaRHE1,+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family,+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development.">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+GUS+histochemistry+to+visualise+lignification+gene+expression+in+situ+during+wood+formation.">The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation.</a> Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).</li><li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants.">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li><li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley.">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li></ol>

ISSA-protokollet är en relativt enkel och effektiv metod för att skapa transgena stamceller vävnader trädslag inom loppet av några månader för analys av gener och promotorer av intresse inblandade i trä och stambildning. Liten ansträngning, utöver att hålla växter vid liv, som krävs för att växa transgen stamvävnad efter ympning som står i kontrast till in vitro-metoder där omfattande odling krävs för att hålla vävnader eller växter, där virkesproduktion kan ta upp till år att påbörja...

Trädstammar bestå av en betydande del av planeterna biomassa och är oerhört biologiska, kulturella och kommersiella betydelse. Sekundär stjälkar skapa habitat genom att tillhandahålla resurser och skydd för många andra livsformer. De levererar många andra tjänster för ekosystemen de bebor och fungerar som en förnybar resurs för framställning av timmer, massa och papper och andra trä- och icke-träprodukter. Sekundär stam utveckling och mer specifikt vedbildning styrs av komplexa molekylära system som reglerar utvecklingen av specifika celltyper, den biokemiska sammansättningen av deras cellväggar och hur de är arrangerade att bilda vävnader och organ. Analysera den molekylära grunden för sekundär stam utveckling och trä bildning förvirrad av många faktorer, inklusive variationen i trä och stam egenskaper inom och mellan stammar, långa generationstider, out-korsning parningssystem, hög heterozygositet, hög genetisk belastning, säsongs dvala, lång mognaegenskapsetableringsperioder och blotta fysiska storleken av mogna träd. Som ett resultat, förståelse av sekundär stam utveckling i förhållande till detaljerad kunskap om de flesta andra aspekter av den molekylära kontrollen av växtutveckling, är fortfarande i sin linda. Ett antal in vitro-tekniker har använts för att studera och förstå sekundär stam utveckling, i synnerhet trä och sekundärvägg bildning. Dessa protokoll involverar användningen av hela anläggningen eller delsystem växt, där antingen transgena växter skapas eller specifika sekundära celler eller vävnad transformeras för att studera specifika aspekter av trä och / eller sekundär stam utveckling 1. Transgena växter kan återvinnas efter genetisk transformation från en mängd olika växtvävnader och celltyper, dock är utvecklingen långsam, särskilt när man analyserar träfiber drag på grund av lång förnyelse och hejda mognadstider (i storleksordningen år), hög teknisk och arbetskraft demands, låg genomströmning av kandidatgener samt svårigheter i föröknings vissa woody växtarter. Liknande tekniker har utvecklats i icke vedartade modellsystem såsom Arabidopsis som framgångsrikt övervinna några av dessa begränsningar, men inte alla sekundära typer stamcells en present i dessa stammar och egenskaper i samband med säsongs eller livslängd kan inte studeras i sådana arter 2. Alternativt, delsystem växt, såsom Pinu s radiata kallus odlingar 3 minska tillhörande tidsramar. Dessa metoder dock är begränsade till studiet av en enskild celltyp och lider liknande begränsningar som noterades för in vitro experiment. På liknande sätt har apikala stamceller kulturer 4 omfattar hela stamceller explants visat lovande men ännu har inte tillämpats för att studera specifika gener eller promotorer av intresse. På senare tid har ett alternativt protokoll som involverar håriga rotkulturerna utvecklats för eucalypts och har varit framgångsrikttillämpas 5, men denna metod kräver fortfarande in vitro odling innebär sekundära rötter snarare än stjälkar och hittills det är begränsat till en enda trädslag. Inducerad somatisk sektorn analys (ISSA), som beskrivs här, har utvecklats för att övervinna några av dessa problem ger en medelhög till hög genomströmning funktionella screeningmetod för gener och promotorer med misstänkta roller i trä bildning och sekundär stam vävnadsutveckling. ISSA är en in vivo-transformation och screeningssystem som utvecklades för att minska den tid det tar att producera transgena celler och vävnad i ett intakt sekundära stammen under övervinnande arbetskraft, tekniska och genomströmning begränsningar av rutinmässigt används in vitro-metoder. De protokoll som beskrivs här gör det möjligt att samtidigt skapa hundratals oberoende transformerade vävnads sektorer och celler i sekundär stammar inom en kort tidsperiod, i de trädslag och vävnad av intresse utan genetic och / eller miljövariation inom relativt korta tidsramar och låga arbetskostnader. Issa in vivo-tekniker beskrevs först för sekundär skaftet 6 och knopp 7 vävnader och har sedan förfinats i sekundärstamvävnad genom studier av gener och / eller projektansvariga i cambial differentiering och inkluderar: tubulin (TUB) 8, fasciclin liknande arabinogalaktan ( FLA) 9, cellulosa-syntas (CESA) 10, sekundärvägg associerade nac domän (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 och riktigt intressant ny gen (RING) H2-protein 13. Dessa studier genomfördes i sekundär stjälkar av poppel och eucalypt växter och som insikter i cellmorfologi, cellväggs kemi och genuttryck. De protokoll som beskrivs här är avsedda att sammanföra erfarenheter som ennd kunskap genom utveckling och tillämpning av ISSA från en rad publicerade och opublicerade studier under det senaste decenniet. De fokuserar på omvandlingen av sekundära stamvävnader 6 in vivo och koncentrera sig på studier med Populus alba &quot;pyramid&quot; klon, Eucalyptus globulus samt 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner. Detta dokument tar forskare genom protokollet från odling av växter och bakterier, transformation av stam vävnader, tillväxt och skörd av vävnad, identifiering av transgena celler och vävnader, förberedelse för fenotypiska bedömningar och metoder för insamling och analys av data. Även tekniker har med framgång använts för att mäta cellväggen monosackarid kompositionen även 9,11, på grund av utrymmesbegränsningar, koncentrerar detta dokument på tekniker som används för att mäta cell- och vävnads morfologi och förståelse genuttryck mönster i sekundär stems endast. Följaktligen är det protokoll som beskrivs lämpad för dem som vill få ytterligare insikter i rollen och / eller uttryck av gener kopplade till sekundära stammar med hjälp av en låg kostnad, tekniskt enkelt och medelhög till hög genomströmning metod.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Plants</td>
			<td style="width:95px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:751px;">Please consult local nursery suppliers for plants as needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">Agrobacterium strain</td>
			<td style="width:95px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:751px;">There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:188px;">Binary vector (gene and promoter)</td>
			<td style="width:95px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:751px;">We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">LB media</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">LB media with agar</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2897</td>
			<td style="width:751px;">A like product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:751px;">The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a&#160; range of companies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">50 ml Screw top tubes</td>
			<td style="width:95px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">2 ml Microtube</td>
			<td style="width:95px;">Watson Bio Lab</td>
			<td style="width:119px;">132-620C</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">MS Media</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9274</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Scalpel blade no 11</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2771</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td style="width:95px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM996</td>
			<td style="width:751px;">This is the best product to use to bind the cambial window post creation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">14 ml round bottom tubes</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">150268</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">EDTA</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Triton</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">X-Gluc</td>
			<td style="width:95px;">X-GLUC direct</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:751px;">You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Potassium Ferricyanide (III)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">244023</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Potassium Ferrocyanide (II)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9387</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Litmus paper</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">WHA10360300</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Single edge razor blade</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">L055</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">L056</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">SEM Pin Stub</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">GTP16111</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Sample vial with screw cap</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">L6204</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Ethanol</td>
			<td style="width:95px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">LR white</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">C025</td>
			<td style="width:751px;">The same product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Embedding Mould</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">RL090</td>
			<td>We recommend this variety, however there are plenty of options available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:188px;">Water Soulable mounting media</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">IA019</td>
			<td>One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">216763</td>
			<td>A like product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9967</td>
			<td>A like product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Safranin O</td>
			<td style="width:95px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:119px;">C138</td>
			<td>A like product could be sourced from another company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:188px;">Quanta Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:95px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:188px;">Image J imaging software</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of induced somatic sector analysis (issa) for studying genes and promoters involved in wood formation and secondary stem development

Sekundär stamtillväxt i träd och tillhörande trä bildning är betydande både biologiska och kommersiella perspektiv. Emellertid är relativt lite känt om den molekylära kontrollen som styr deras utveckling. Detta beror delvis på grund av fysiska, resurs och tidsbegränsningar som ofta förknippas med studier av sekundära tillväxtprocesser. Ett antal in vitro-tekniker har använts, vilket var antingen växtdel eller hela växten systemet i både woody och icke-vedartade växtarter. Men frågor om deras tillämplighet för studier av sekundära stam tillväxtprocesser, motspänstighet av vissa arter och arbetsintensitet är ofta oöverkomliga för medelhög till hög genomströmning applikationer. Även när man tittar på sekundär stam utveckling och vedbildning de specifika egenskaper som omfattas av undersökningen kan endast bli mätbar sent i ett träd livscykel efter flera år av tillväxt. Att ta itu med dessa utmaningar alternativ in vivo protocols har utvecklats, som heter inducerad Somatic sektoranalyser som involverar skapandet av transgena somatiska vävnads sektorer direkt i anläggningens sekundära stam. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla ett effektivt, enkelt och relativt snabbt sätt för att skapa transgena sekundära växtvävnad för genen och promotorn funktionell karakterisering som kan utnyttjas i en rad olika trädslag. Resultaten som presenteras här visar att transgena sekundära stamceller sektorer kan skapas i alla levande vävnader och celltyper i sekundär stammar av olika trädslag och att trä morfologiska egenskaper samt promotor uttrycksmönster vid sekundär stjälkar kan lätt bedömas lätta medelhög till hög genomströmning funktionell karakterisering.

Med hjälp av detta protokoll alla levande sekundära stamcells och vävnadstyper har visat sig vara känsliga för A. tumefaciens transformationer och har definierats i typer sektorn baserat på celltypen som ursprungligen transformerade och det efterföljande utvecklingstillväxtmönster. Sektor typer är periderm, floem, cambial, sår parenkym och Tylose (Figur 1b, 1c, 1d) och kan hittas i konsekventa platser beskriver i rest...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development at JoVE.com

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.

Användning av inducerad Somatic Sector Analysis (ISSA) för att studera gener och projektansvariga i trä Bildning och sekundär Stem utveckling

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

The overall goal of Induced Somatic Sector Analysis is to provide a medium to high throughput technique for the functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. This method can help answer key questions around where and when danger expressed as well as their role in biologically important processes such as wood formation and secondary stem development. The main advantage of this technique is that it is efficient, easy and relatively a fast procedure that is applicable to a wide range of tree species.To begin, prepare a clean, 50 milliliter screw cap tube with 19 milliliters of fresh, 28 degree Celsius LB medium with the appropriate antibiotics for bacterial selection. Add one milliliter of A.tumefaciens culture and check the optical density, or OD, at 600 nanometres. If the OD is above 0.1, dilute further with warm LB.Place the A.tumefaciens culture into a shaking incubator until the OD 600 is between 0.4 and 0.6.Once this is achieved, centrifuge the cells for 15 minutes at four degrees Celsius and 1, 000 x g. Decant the liquid from the tube and immediately re-suspend the cell pellet with one milliliter of cooled MS medium. Transfer the suspension to a clean, two milliliter microtube and store on ice until required.Begin the experiment during the spring or early summer and select plants with an active and fast growing cambium. This is confirmed if the phloem can be easily peeled from the xylem. Identify a straight section of stem near the base of the plant and remove any leaves or branches.Using a sharp scalpel, cut a one square centimeter cambial window by creating two parallel, 20 millimeter incisions through the phloem at five millimeters apart and then a single, horizontal cut that bisects the two vertical cuts at the basal end. Heal the phloem strip upwards exposing the developing xylem tissue. And then, using a pipette, add sufficient inoculation medium to fully wet the surface of the exposed xylem.Immediately, reinsert the phloem strip into the stem and bind it into place tightly with parafilm. Repeat these inoculation steps for all genes or promoters of interest creating new cambial windows at least one centimeter above or below existing windows and at a 90 degree offset. Additionally, inoculate windows with the positive and negative control vectors on the same stem or stems, as the experimental inoculates.Monitor stem growth periodically and once radial growth of at least five millimeters has been observed, harvest the tissue for a beta-glucuronidase, or GUS assay. To harvest the test material, first excise the cambial window from the stem removing any tissue that is not part of new growth. For studies relating to mature xylem and phloem cell or tissue morphology, peel the phloem from the xylem.Alternatively, for investigations requiring that the cambial zone remain intact, or promoter expression patterns to be assessed, slice the cambial window transversely using a razor blade to create discs of between 0.5 and one millimeter thickness. Place the harvested cambial window tissues into individual, 14 milliliter round bottom tubes and rinse twice in 0.1 molar phosphate buffer at pH 7 for five minutes each time ensuring that the tissue is completely submerged. At the end of the second rinse, take care to remove all excess solution.Next, add five milliliters of GUS reagent to each tube. If this does not completely cover the tissue sample, add additional reagent. Incubate the tubes for ten minutes at 55 degrees Celsius in the dark.Following this, incubate the tubes for a further 12 to 16 hours on a shaker at 37 degrees Celsius in the dark using gentle agitation. Upon removal from the incubator, take a random subset of the tubes and check the pH of the GUS reagent using litmus paper with pH range of zero to seven. If any of them have a pH lower than six, label them and check the remainder of the tubes.Label and exclude any tubes with a pH lower than six. Decant the GUS reagent from the tubes and replace it with sufficient 70 percent ethanol to cover the tissue. Store the samples at four degrees Celsius until needed.Using a clean pair of forceps, remove all the cambial window tissue from a sample tube and place it onto a small tray or petri dish for microscopic visualization. Place the sample under the lens of a dissecting microscope between 1X and 4X magnification and identify and tally the number of cells or tissues displaying bright blue staining. In examples where the phloem was removed, count the number of sectors in cambial tissue found on the surface of the developing xylem.For samples cut into discs, count the number of sectors found in the different cell or tissue types. Ensure that both sides of the disc are viewed and that sectors that occur across two discs are matched to ensure that numbers are not overestimated. Place only the tissue containing sectors back into the tube containing 70 percent ethanol and store until needed.Repeat the analysis for any additional cambial windows harvested including the positive and negative controls. To aid in the accurate identification in the classification of sectors, we suggest you become familiar with secondary stem anatomy and development including stem responses to wounding. This figure shows several successful transformations seen here as regions of blue staining.An example phloem peel window displays multiple transformed sectors and discs harvested from two tree species show sectors of transformation and subsequent radial growth. Transformation in a range of tissue types can also be observed. Here stem sectors can be seen in the periderm, phloem, wound parenchyma, and several other tissue regions of white poplar.This image shows the results of gene promoter expression in cambial derivatives. In this example, we see the proportion of staining in each tissue type in a trial involving a range of CesA promoters from eucalyptus grandis transformed into stems of eucalypt hybrids. Expression in the phloem, developing and developed xylems is represented as a percentage.Average number of transformation events per centimeter of cambium inoculated can also be calculated for each promoter or gene of interest. This table shows the data for typical sectors identified in eucalypt and poplar subjects transformed with a positive control or promoter of interest analyzed using the disc harvesting method. Once mastered, this technique can provide a fast, efficient and widely applicable method for dissecting the complex nature of cambial differentiation with formation in secondary stem development.After watching this video, you should have a good understanding of how to prepare plants and bacteria, how to transform, grow and harvest stems as well as how to identify and classify transgenic tissue for phenotypic assessment.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analys av omgivnings Partiklar-inducerad kromosomavvikelser Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid-härledda metod för att transportgener och proteiner över Cellular och organeller hinder i växter

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Övergående uttryck av främmande gener i insekt celler (sf9) för Protein funktionell analys

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: kvantitativa Semi-automated typning av Killer-cell immunglobulin-like Receptor gener

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral Vector plattform för effektiv distribution av epigenomet-redigeringsverktyg i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived sjukdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...