Name: measurement of in vitro integration activity of hiv-1 preintegration complexes
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00
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この研究の一部は、CDにNIDA / NIHからの助成金DA024558、DA30896、DA033892、およびDA021471によってサポートされています。また、ヴァンダービルトCTSAはUL1RR024975、NCRR / NIH、NIMHD / NIHからU54グラントMD007593、およびテネシーCFARグラントP30のAI110527からMeharryトランスレーショナルリサーチセンター（MeTRC）CTSAグラントU54のRR026140を付与し、RCMIグラントG12MD007586を認めます。

1.ウイルス産生注：、感染性HIV-1の高力価を生成する活性化されたデンドリマーベースのトランスフェクション試薬を用いて、感染性HIV-1分子クローンによるヒト胎児腎臓（HEK）細胞株293Tをトランスフェクトします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、同等の結果が得られることが観察されています。 <ol><li>バイオセーフティレベル2（BSL2）ラボでは、シード...

<ol>
	<li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4+antigen:+physiological+ligand+and+HIV+receptor.">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li><li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+HIV+entry.">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li><li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA.">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li><li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes.">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li><li>Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro.">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li><li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro.">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li><li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+structure+of+an+integration+intermediate.">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li><li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro.">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li><li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences.">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li><li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+retroviral+integration.">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li><li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production.">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li><li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis.">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li><li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity.">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li><li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration.">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li><li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration.">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li><li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activities+of+human+immunodeficiency+virus+(HIV)+integration+protein+in+vitro:+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA.">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li><li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination.">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li><li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes.">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li><li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes.">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li><li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4++T+cells:+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients.">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li></ol>

レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合6、7、18を?...

初期および後期のイベント：標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体（CCR5またはCXCR4）1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド（CA）コアが細胞質2に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素（RT）及びインテグラーゼ（IN）、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写（RTC）とプレインテグレーション複合体（PIC）の文脈で機能IN、3、4、5 &lt;SUP&gt;、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート（R）ユニークな配列の（5時U5 &#39;末端）および（3時U3&#39;末端）に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖（ds）DNAコピー（vDNA）へのウイルスのssRNAゲノムを変換します。この逆転写プロセスは、従ってvDNA 7,8の両端の長い末端反復（LTR）を生成し、U5及びU3配列の重複をもたらします。その後、PIC-関連INは宿主染色体9、10、11にvDNAの統合を可能にする2つの連続生化学反応を触媒します。まず、細胞質内で、多量体の両方のLTR 12に係合および3 &#39;末端のそれぞれからジヌクレオチドを切断します。この3 &#39;末端の処理は、各3&#39;末端vDNAの（CA OH）にヒドロキシル基を生成します。INは千鳥状に染色体DNAの両方の鎖を切断する求核剤としてOH vDNA CAを使用する、請求次に、PICは、核に入稿。同時に、INは協調染色体DNAの反対の鎖上に得られたリン酸ジエステル結合にvDNAの両端を継ぎ。この鎖の転写工程に続いて、宿主細胞機構は、5 &#39;vDNAの両端と修理に2つの不対ヌクレオチド組み込み部位の接合部に続く一本鎖ギャップを削除します。初期の事象は、このようにHIV-1ゲノムの統合されたDNAコピー（プロウイルス）の設立で絶頂に達します。プロウイルスは、ウイルスにコードされたタンパク質の発現を含む、後のイベントを、開始し、効率的なウイルス遺伝子の発現に適した環境を提供します。未成熟ウイルスのアセンブリ。そして、リリース、および感染性ビリオン13への成熟出芽。 精製された組換えレトロウイルスINはに有能ですin vitroで 、行って、両方の3 &#39;末端プロセシングおよび鎖移転活動は、上の外因LTRのような基質DNA供給します。このような精製された組換えINを用いて生化学的研究は、vDNA統合14、15、16、17の重要な側面を明らかにしました。しかし、自然感染とは異なり、このインビトロ生化学反応は、標的DNAに基質DNAの両端の協調統合をサポートしていません。これとは対照的に、急性感染細胞から単離されたレトロウイルスのPICは、協奏異種標的DNAの中に内在性vDNAの両端を統合します。これは、単離された天然のPICを使って広く採用し、I nはインビトロインテグレーション（IVI）アッセイのその後の改良につながりました。 最初に報告されたレトロウイルスIVIアッセイでは、細胞からの細胞質抽出物は、組換えマウスに感染させましたそのLTRに大腸菌supF遺伝子を有する白血病ウイルス（MLV）は、IN活動の源を務め、および溶菌成長の欠損変異体ラムダファージのDNAは、外因的に標的DNAとして供給しました。組換えMLV DNAの統合を成功さは、ファージDNAにコピーして、その後のsupF式は、組換えファージのプラーク形成能力の回復につながりました。しかし、この実験的な戦略は面倒であり、間接的な方法で統合を測定します。このような警告に対処するために、vDNAは外因性の線形化バクテリオphiX174 DNAに組み込まれ、内因性の尺度としてPIC関連IVI活動を定量化するサザンブロットベースの間接末端標識アッセイは、18、7、6開発されました。この方法は、組込み事象の直接的な測定を提供するが、PICの調製の比較的高い量は技術的に困難なままである、必要とされます努力。これを回避するには、写真のわずかな量を必要とするネストされたPCRベースのアッセイは、19 5、4開発されました。 この報告書では、我々は、in vitroの方法で 、ネストされたベースのPCRの更新バージョンを記述自然感染時に発生するHIV-1 PIC媒介統合アクティビティを再現するために考案しました。この方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて測定された内因性のPIC活性の供給源として、HIV-1に感染した標的細胞の細胞質抽出物を使用します。 PICを単離し、それらの統合の活動を測定するための手順は、エンゲルマンの実験室20によって発行されたプロトコルから、修正を加えて、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、外因性の直鎖標的DNA 21から得られたDNA産物を提供することによって開始されますこの統合化反応を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。この方法の詳細な説明のためのプロトコルのセクションを参照してください。 レトロウイルスのPICを用いたin vitroの研究では、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムの理解にとINの阻害剤の開発に大きな進歩につながっています。 HIV-1の統合におけるウイルスと宿主因子の役割を決定し、薬剤耐性との闘いに向けて新たな抗ウイルス薬の開発、マッピング、HIV-1の統合サイトでの最近の増加の焦点に基づいて、我々は、IVIアッセイの関心の高まりや広範な使用を想定します、この報告書に記載のものなどがあります。これは、今度は、につながりますそれによって、そのアプリケーションの範囲を多様化する方法で将来の改良、。

<table align="left" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:679px;" width="679">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Fetal bovine serum (FBS)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			10437-028
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:34px;">
			Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)
			</td>
			<td style="width:198px;height:34px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;height:34px;">
			10438-026
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:42px;">
			Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)
			
			</td>
			<td style="width:198px;height:42px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;height:42px;">
			11995-065
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			11875-093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Phosphate buffered saline (PBS) (1X)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			20012-027
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Trypsin-EDTA (0.25%)
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			25200-056
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Penicillin-Streptomycin solution (100x)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Cellgro/Mediatech
			</td>
			<td style="width:138px;">
			30-002-CI
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HEK293T cells (293T)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			American Type Culture Collection (ATCC)
			</td>
			<td style="width:138px;">
			CRL-3216
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3
			</td>
			<td style="width:198px;">
			NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			114
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			PolyFect transfection reagent
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Qiagen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			301107
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			DNase
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Calbiochem/Merckmillipore
			</td>
			<td style="width:138px;">
			260913
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Immulon 2HB 96-well plates
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Thermo Scientific
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			3455
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Triton X-100
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			T9284
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody
			</td>
			<td style="width:198px;">
			NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			1513
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			---
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Donor bovine serum
			</td>
			<td style="width:198px;">
			&#160;Gibco/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			16030074
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:78px;">
			Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) - Prepare fresh before use.
			
			</td>
			<td style="width:198px;height:78px;">
			---
			</td>
			<td style="width:138px;height:78px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) - Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4&#176;C.
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			---
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Recombinant p24 protein
			(Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # ----)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Dr. Wesley Sundquist
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HIV IgG
			</td>
			<td style="width:198px;">
			NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			3957
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Pierce/ThermoFisher
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			31412
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			TMB Microwell Peroxidase substrate system
			</td>
			<td style="width:198px;">
			KPL, Inc.
			</td>
			<td style="width:138px;">
			50-76-00
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			SupT1 cells
			</td>
			<td style="width:198px;">
			American Type Culture Collection (ATCC)
			</td>
			<td style="width:138px;">
			CRL-1942
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HEPES pH 7.2-7.5
			(ready-to-use solution)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			15630-080
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Potassium chloride (KCl) solution
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			60142
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Magnesium chloride (MgCl2) solution
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			M1028
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			43815
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Aprotinin
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			A6106
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Digitonin
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			D141
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			RNase A
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			12091-021
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:29px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:198px;height:29px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;height:29px;">
			S0389
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			phiX174 Replicative Form 1 DNA
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:138px;">
			D1531
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			PhiX174-F primer:
			5&#8217;-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3&#8217;
			
			PhiX174-R primer:
			5&#8217;-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3&#8217;
			
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen and/or IDT-DNA
			</td>
			<td style="width:138px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			dNTP mix
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:138px;">
			U1515
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Go Taq DNA Polymerase
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:138px;">
			M3005
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Qiaquick gel extraction kit
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Qiagen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			28706
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Ultrapure distilled water
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Tris-EDTA (TE) buffer (100X)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			T9285
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Sodium dodecyl sulphate (SDS)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			L3771
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:50px;">
			Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0
			</td>
			<td style="width:198px;height:50px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;height:50px;">
			E7889
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Qiagen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			19131
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Phenol (equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0 and 1&#160;mM EDTA)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			P4557
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Chloroform
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			288306
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Glycogen (5 mg/ml solution)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Ambion/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			AM9510
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Sodium acetate (3M, pH 5.2)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			57899
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			E7023
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			First round LTR primer:
			5&#8217;-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3&#8217;)
			First round phiX174 primer:
			5&#8217;-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3&#8217;
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen and/or IDT-DNA
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Second round LTR-R primer:
			5&#8217;-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3&#8217;
			Second round LTR-U primer:
			5&#8217;-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3&#8217;;
			
			Second round Taqman probe:
			&#160;5&#8217;-56- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC
			CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3&#8217;
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen and/or IDT-DNA
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			iQ Supermix
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Bio-Rad
			</td>
			<td style="width:138px;">
			170-8862
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of in vitro integration activity of hiv-1 preintegration complexes

HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド（CA）コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素（RT）は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写（RTC）は、二本鎖DNAコピー（vDNA）へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体（PIC）は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ（IN）は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 &#39;末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイで PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。

HIV-1のPICの単離 急性感染のSup-T1細胞からのHIV-1のPICの単離のために使用されるプロトコルの概略図を図1に示されています。このプロトコルは、エンゲルマンらによって記載された方法に由来します。 19、20。 HIV-1のPICは、感染細胞内で組み立てら...

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Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

The overall goal of this procedure is to measure the in vitro integration activity of pre-integration complexes, or PICs, isolated from HIV-1 infected SupT1 cells. This method will answer some of the key questions in HIV biology, specifically how certain host factors and viral factors, for example, viral capsid, plays a role in HIV-1 DNA integration, and doing so will help us design or identify novel targets for antiretroviral therapy. The main advantage of this method is that it requires relatively small amount of the pre-integration complex, or PIC, preparation for measuring the integration activity in vitro.The implications of this technique can extend towards diagnosis as well as therapy of HIV-1 AIDS, and this is because the earlier versions of this technique have been critical in the discovery of HIV-1 integrase inhibitors, which are one of the major anti-HIV drugs in clinical use today, so this method can not only be used to understand HIV-1 integration, but it can be also applied to study other retroviruses, such as RSV and MLV. Demonstrating this protocol will be Dr.Muthukumar Balasubramaniam, who is a post-doctorate fellow in the laboratory. To infect SupT1 with HIV-1, in a BSL-2 lab, maintain SupT1 cells between one and two times 10 to the sixth cells per milliliter in Roswell Park Memorial Institute or RPMI medium supplemented with 10%FBS and Pen-Strep.After generating high titers of infectious HIV-1 according to the text protocol, pool the SupT1 cells from the culture flasks, mix well by pipetting, and use trypan blue exclusion staining in a hemocytometer to determine the viable cell count. Aliquot eight times 106 cells per virus infection in 50 milliliter conical centrifuge tubes, then centrifuge the cells in a swinging bucket rotor at 500 times g and 25 degrees Celsius for five minutes. Without removing the cell culture medium, transfer the tubes containing pelleted cells to the BSL-3 lab for further processing, then carefully aspirate the medium from the tube without disturbing the pellet.Next, add 30 milliliters of DNase I treated virus inoculum to the cells and mix by gently pipetting, then distribute the mixture evenly between two six well tissue culture plates. For spinoculation, place the culture plates in plate carriers and centrifuge in a swinging bucket rotor at 480 times g and 25 degrees Celsius for two hours, then incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for five hours. To harvest and lyse the infected cells, pool the cells corresponding to each infection into a 50 milliliter conical centrifuge tube.Centrifuge the cells at 300 times g and 25 degrees Celsius for 10 minutes, then carefully aspirate or pipette the supernatant. To remove any residual virus particles, wash each pellet by adding two milliliters of buffer K minus minus and spin the sample again, then without disturbing the pellet, carefully remove the supernatant by aspiration or with a pipette before repeating the wash one more time. After carefully removing any residual buffer with a micropipette, use ice cold lysis buffer K plus plus to gently re-suspend each pellet and transfer to a two milliliter microcentrifuge tube.To prepare cytoplasmic pre-integration complexes, or PICs, rock the sample at room temperature for 10 minutes, then place the tubes into a rotor pre-cooled to four degrees Celsius, and centrifuge at 1, 500 times g and four degrees Celsius for four minutes. Without disturbing the pellet, carefully transfer the supernatant to a fresh microcentrifuge tube and spin at 16, 000 times g and four degrees Celsius for one minute. Carefully transfer the supernatant to a fresh microcentrifuge tube, then add RNase A to a final concentration of 20 micrograms per milliliter, and incubate the contents at room temperature without rocking for 30 minutes.Add sucrose to a final concentration of 7%and mix well by gently pipetting, then prepare aliquots of the PICs in microcentrifuge tubes. Flash freeze in liquid nitrogen and place in a negative 80 degrees Celsius freezer for long term storage. To prepare the target DNA used in the in vitro integration or IVI assay, assemble the PCR mixtures to amplify a 2.0 kilobase region from the phiX174 plasmid DNA using the custom made primers phiX174-Forward and phiX174-Reverse, and carry out PCR using the program according to the text protocol.After gel purifying and aliquoting the sample, add 600 nanograms of target DNA to 200 microliters of PICs. Mix well and incubate at 37 degrees Celsius for 45 minutes. Stop the IVI reaction by adding SDS, EDTA and proteinase K, then thoroughly mix the reaction contents and incubate at 56 degrees Celsius overnight.The following day, to purify the total DNA from the IVI reaction, add an equal volume of phenol to the deproteinized sample. Mix vigorously by vortexing and centrifuge for two minutes. Carefully remove the upper aqueous phase and transfer it to a fresh tube before repeating the phenol extraction, then add an equal volume of one to one phenol chloroform.Mix the sample by vortexing and centrifuge the tube for two minutes, then transfer the upper aqueous phase to a fresh tube. After extracting with chloroform according to the text protocol, precipitate the DNA from the aqueous phase by adding 0.1 micrograms per microliter of glycogen, 0.3 molar sodium acetate and 2.5 volumes of ice cold 100%ethanol. Place the tube at negative 80 degrees Celsius overnight.The next day, centrifuge the sample at 16, 000 times g and four degrees Celsius for 30 minutes, then carefully remove the supernatant without disturbing the pellet. To carry out PCR for quantifying PIC activity, begin with the first round of conventional PCR using primers targeting the viral LTR and the phiX174 DNA to amplify the junctions of the integrated HIV-1 DNA. Assemble the master mix minus the template DNA as outlined here, then dispense 45 microliter aliquots into separate PCR tubes and add five microliters of template DNA or nuclease free water as a control.Run the reaction in a thermocycler using the program outlined in the text protocol, then carry out a second round of quantitative PCR and analyze the data according to the text protocol. In this IVI assay, SupT1 were spinoculated with DNAse I treated HIV-1, and the absence or presence of the HIV-1 integrase inhibitor, Raltegravir. After incubation, PICs were isolated and the purified DNA was analyzed for the integration of viral DNA.As shown here, the HIV-1 PICs robustly integrate the associated viral DNA into the target DNA and the IVI efficiency of PICs were greatly reduced in the reactions supplemented with Raltegravir, which strongly implicates the integration activity measured in this assay to HIV-1 integrase. The control reactions did not show any integration activity. In addition, the control that excluded Taq polymerase in the first round of PCR did not amplify integration products.Notably, the data from the PICs alone control indicated that the nested qPCR strategy specifically measured the integrated viral DNA, but not the PIC-associated viral DNA. Collectively, these data demonstrate the PIC-associated integration activity. Once mastered, virus preparation and PCR assays for quantifying the PIC activity can be completed in a week.Infection of the SupT1 cells and isolation of the PICs from the infected cells can be done in a day. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate HIV-1 PICs and measure the in vitro integration activity. Don't forget that working with high titers of infectious HIV-1 can be extremely hazardous and appropriate precautions, including protective clothing such as aprons and gowns, double gloves, and protective eyewear, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...