Name: an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

Vi är tacksamma för Annika Engbers och Frank Kurth för deras utmärkta teknisk support och Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) för hjälp diskussioner om Teer mätningar. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 till HW och LK, CRC TR128, projekt A08; Z1 och B01 till LK och HW, och tvärvetenskapligt center för klinisk forskning (medicinska fakulteten i Münster) licensnummer KL2 / 2015/14 till LK.

För alla experiment, möss uppfödda och hölls under specifika patogenfria förhållanden i centrala djuranläggning vid universitetet i Münster, enligt tyska riktlinjer för djurvård. Alla experiment utfördes enligt riktlinjerna i djurexperimentella etikkommitté den och godkänts av de lokala myndigheterna i Nordrhein-Westfalen, Tyskland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolering och kultur OBS: Isolera MBMECs såsom tidigare beskrivits i detalj 14 med följande modifikationer: </...

Flera steg av den beskrivna protokollet är väsentliga för ett lyckat experiment. Under den initiala MBMEC isolering och odling, är det avgörande att arbetet utförs under sterila förhållanden så mycket som möjligt, för att förhindra kontaminering av cellkulturen med svampsporer eller bakterier. För att erhålla en ren kultur av EC, är det rekommenderat att använda ett medium innehållande Puromycin för de första tre dagarna, vilket möjliggör överlevnad EC, men inte andra celltyper (särskilt pericyter...

Den blod-hjärnbarriären separerar den systemiska cirkulationen från det centrala nervsystemet (CNS) 1 - 3. Det ger en fysisk barriär som hämmar den fria rörligheten av celler och spridning av vattenlösliga molekyler och skyddar hjärnan från patogener och potentiellt skadliga ämnen. Förutom dess barriärfunktion, den BBB möjliggör leverans av syre och näringsämnen till hjärnparenkymet, som säkerställer en väl fungerande neuronal vävnad. Funktionella egenskaper hos BBB är starkt reglerad av dess cellulära och acellulära komponenter, med högspecialiserad EC är dess huvudsakliga konstruktionselement. EC av BBB kännetecknas av närvaron av tight junction (TJ) komplex, bristen på fenestrationer, extremt låg pinocytic aktivitet, och permanent aktiva transportmekanismer. Andra komponenter i BBB EG basalmembranet, pericyter inbäddning endotelet, astrocytiska slut fötter och = tillhörande parenchymal basalmembranet också bidra till utveckling, underhåll och funktion BBB 2,4 - 6 och, tillsammans med neuroner och mikroglia, utgör neurovaskulära enheten (NVU), som gör det möjligt för en väl fungerande CNS 7-9. I en mängd olika neurologiska sjukdomar, såsom neurodegenerativa, inflammatoriska eller infektionssjukdomar, är funktionen hos BBB äventyras 2,5,10b. Dysreglering av TJ-komplex och molekylära transportmekanismer leder till ökad BBB permeabilitet, leukocyter extravasering, inflammation och nervskada. För att studera BBB: egenskaper under sådana patofysiologiska tillstånd, har olika in vitro BBB: modeller etablerats 9,11,12. Tillsammans har de gett värdefulla insikter i de förändringar av barriär integritet, permeabilitet samt transportmekanismer. Dessa modeller använder endotelceller från människa, mus, råtta, gris eller bfår ursprung 13-18; primära endotelceller eller cellinjer odlas antingen som en monokultur eller tillsammans med pericyter och / eller astrocyter, för att efterlikna mer noggrant BBB in vivo 19-25. Under de senaste åren, har mätning av transendotelial elektrisk resistans (TEER) blivit en allmänt accepterad verktyg för att bedöma endotelial barriäregenskaper 26,27. TEER speglar impedansen till jonflödet över cellmonoskiktet och dess minskning ger en känsligt mått på nedsatt endotelial barriär integritet och därmed ökad permeabilitet. Olika Teer mätsystem har utvecklats, bland annat Epithelial Voltohmmeter (EVOM), Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS), och realtidscellanalys 15,28 - 30. TEER avspeglar motståndet mot jonflöde mellan angränsande ECS (paracellulär väg) och är direkt proportionell mot denbarriärintegritet. I impedansspektroskopi 27,31, är komplex totala impedansen (Z) mäts, vilket ger ytterligare information om barriär integritet genom att mäta Ccl. Ccl avser den kapacitiva strömmen genom cellmembranet (transcellulär väg): cellskiktet fungerar som en kondensator i den ekvivalenta elektriska kretsen, separation av laddningar på båda sidor av membranet och är omvänt proportionell mot barriärintegritet. När odlas på permeabla skär, EC följa, föröka sig och spridas över det mikroporösa membranet. Detta motstår bakgrunden kapacitiv ström av insatsen (som i sig fungerar som en kondensator) och leder till en minskning i kapacitansen tills den når sin minimala nivå. Detta följs av inrättandet av TJ komplex som tätar av utrymmet mellan intilliggande EC. Detta begränsar jonflödet genom paracellulära vägen, och TEER ökar tills den når sin platå. Under inflammatoriska tillstånd emellertid den endothelial barriären äventyras: TEER minskar då TJ komplexen få störs och Ccl ökar när den kapacitiva komponenten av insatsen ökar igen. Vår TEER mätning använder automatiserade cell övervakning 32-systemet: det följer principen om impedansspektroskopi och sträcker sina tidigare ansökningar. Här beskriver vi en in vitro-BBB modell som gör studiet av barriäregenskaperna, inklusive interaktion av hjärn endotel med immunceller; i synnerhet aktiverade T-celler. Sådana patofysiologiska tillstånd observeras i autoimmuna sjukdomar i CNS, såsom multipel skleros och dess djurmodell experimentell autoimmun encefalomyelit 33-37. Här är ett avgörande steg i trans av encefalitogena, myelinspecifika T-celler över BBB. Detta följs av deras reaktivering i perivaskulära utrymmet och inträde i hjärnparenkymet, där de rekryterar andra immunceller och migdiate inflammation och efterföljande demyelinisering 1,35,38. Emellertid molekylära mekanismer av interaktionen mellan sådana T-celler och endotelceller, de huvudsakliga beståndsdelarna i BBB, är inte väl förstådd. Vår protokoll syftar till att fylla denna lucka och ge nya insikter i konsekvenserna för endotelceller (dvs barriär integritet och permeabilitet) vid sin direktkontakt och komplext samspel med aktiverade T-celler. Protokollet som beskrivs här utnyttjar primär mushjärna mikrovaskulära endotelceller, som odlats som ett monolager på släppliga insatser med mikroporösa membran. Endotelceller samodlas med CD4 + T-celler, vilket kan vara pre-aktiverade antingen polyklonalt eller på ett antigenspecifikt sätt. Co-kultur av MBMECs med föraktiverade, men inte naiva T-celler inducerar en minskning av TEER och en ökning av Ccl, som ger ett kvantitativt mått på MBMEC dysfunktion och barriärstörningen. teknikenär icke-invasiv: det använder inbyggd i stället för chopstick elektroder, som förhindrar större störning i EG monoskiktet; den kan användas för att övervaka barriärfunktion utan användning av cellmarkörer. Det gör kontinuerliga mätningar i ett automatiserat sätt och möjliggör en oberoende bedömning av de två spärrparametrar (Teer och CCL) samtidigt över tiden. Metoden är också tillräckligt känsliga för att skilja mellan olika nivåer av T-cellsaktivering och effekterna av sådana T-celler på EC. Den kan användas i ett brett spektrum av funktionella analyser: olika cytokiner och / eller kemokiner är inblandade i inflammatoriska processer kan läggas till co-kultur MBMECs och T-celler; blockerande antikroppar mot celladhesionsmolekyler på antingen EG eller T-cell-sidan kan användas; och hämmare av T-cellsaktivering markörer eller deras cytolytiska egenskaper kan tillsättas under T-cells priming eller deras co-kultur med EC. Analysen är också användbar för T-celltransmigrationanalyser, eftersom det kan fungera som en kvalitetskontroll av MBMEC monoskikt integritet före tillsatsen av T-celler. Allt detta gör denna metod ett mångsidigt och tillförlitligt verktyg för att studera BBB in vitro, med fokus på effekten av aktiverade T-celler på EG monoskikt integritet. Detta är särskilt viktigt för att förstå mekanismerna i BBB störningar i patogenesen av autoimmuna sjukdomar, såsom MS och dess djurmodell EAE, där självreaktiva, encefalitogena T-celler över BBB och orsaka inflammation och nervskada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>cellZscope</td>
			<td>nanoAnalytics GmbH</td>
			<td>www.nanoanalytics.com</td>
			<td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
			<td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>www.beckmancoulter.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo7.6.5 software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>www.flowjo.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>for TEER measurement as the main readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650 180</td>
			<td>flat-bottom; for MBMEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>round-bottom; for immune cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for T cell and B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td>for CD4+ T cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD19 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-201</td>
			<td>for B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD11c MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2 (CSL2)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase (C/D)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-1L</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+ GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>for MBMEC and immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>for harvesting MBMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9891</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM + 1% L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td>for T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418Q</td>
			<td>protect from light; for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse MOG35&#8212;55 peptide</td>
			<td>Biotrend</td>
			<td>BP0328</td>
			<td>for antigen-specific T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3 Ab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100302</td>
			<td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553294</td>
			<td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554408</td>
			<td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granzyme B Inhibitor II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>368055</td>
			<td>recommended final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116005</td>
			<td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Figur 1 ger en allmän översikt över in vitro BBB modell som används för att studera interaktionen mellan T-celler och endotelceller. Experimentet består av tre viktiga steg. Det första steget är isolering av primära MBMECs från hjärn cortex, och deras kultur i fem dagar. När de når sammanflytning i cellkulturplattan, är MBMECs trypsineras och såddes på permeabla skär, vilka därefter placeras i TEER instrumentet. Den TEER och Ccl av MBMECs mäts...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av blod-hjärnbarriären Använda impedans spektroskopi: Fokus på T-cell-endotelceller interaktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

The overall goal of this experiment is to study the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells. This method helps to answer key questions in the neuroimmunology field, such as how does the direct interaction between T cells and endothelial cells affect blood-brain barrier integrity and permeability. The main advantage of this technique is that it enables automated, real-time assessment of barrier function upon targeted modulation of T cell and endothelial cell interaction.The implications of this technique extend toward therapy of autoimmune CNS disorders, because it provides insight into T cell mediated blood-brain barrier breakdown, a crucial step into pathogenesis of such diseases. This method focuses on marine blood-brain barrier properties during EAE. But it can also be applied to red or human blood-brain barrier models, as well as studies of other autoimmune CNS disorders.Generally, individuals new to this method may struggle because of possible difficulties with optimal timing of combined primary endothelial cell culture and T cell activation. We first developed this method when we set off to investigate effects of different T cell activation levels on the blood-brain barrier properties during EAE, an animal model of multiple sclerosis. Visual demonstration of this method is critical, as setting up T cell and endothelial cell co-cultures is difficult to learn, because initial variations in T between wells may need to subsequent misrepresentations of the results.To begin this procedure, on day five after MBMEC isolation, precoat the permeable inserts with 80 microliters of MBMEC coating solution per insert. Incubate them at 37 degrees Celsius, and 5%carbon dioxide, for three hours. After removing the MBMEC coating solution from inserts, wash MBMECs by adding two milliliters of room temperature PBS to each well, and aspirating it after one minute, and then repeat this procedure once more.Next, add 0.05%Trypsin EDTA at 300 microliters per well and incubate it for five to ten minutes. Subsequently, add two milliliters of MBMEC medium to each well to stop trypsinization. Then, transfer the collected cells to a 15 milliliter centrifugation tube and centrifuge the sample at 700 times g for eight minutes at four degrees Celsius.After eight minutes, discard the supernatant and resuspend the cells in one milliliter of MBMEC medium without puromycin. To count the cells, mix 90 microliters of 0.04%trypan blue. With 10 microliters of cell suspension, pipette 10 microliters of the mixture between the glass cover and the hemocytometer.Next, cede two times 10 to the fourth cells per insert. Add 810 microliters of MBMEC medium to the lower compartment of each well and place the plate with the inserts in the incubator until ready to proceed with TEER measurement. To stimulate CD4 positive T cells, precoat a round-bottomed 96 well plate with purified anti-mouse CD3 antibody at a desired final concentration for three hours at 37 degree Celsius.After isolating the T cells, wash the precoated plate twice with PBS. Next, add purified anti-CD28 antibody to the isolated T cells at a desired final concentration and mix well. Then, cede the T cells and leave them at 37 degrees Celsius for two to three days.To set up TEER measurement, place the 24 well module of the TEER instrument in the laminar flow hood. Remove the lids and place the inserts with MBMECs in the instrument, using forceps. Next, pipette 810 microliters of the fresh medium to the lower compartment of the module wells, added carefully between the insert and the wall of the module well.After that, close the lids and place the instrument in the incubator. Connect the instrument to the computer. Then, turn on the instrument controller and open the software.In the pop-up window, select New Measurement"Check show TER"and show Ccl"boxes. Then, press start. After completing the first measurement, select check all wells"in the Results tab to see all TEER and Ccl values.Then, save the file. Next, choose the time point to co-culture MBMECs with T cells when Ccl is stable and lower than one microfarad per square centimeter and TEER has reached its maximum level. Carefully inspect the absolute TEER and Ccl values and exclude the wells in which MBMECs have not developed confluent enough monolayers by unchecking such wells.Group the rest of the wells by right-clicking on the wells and selecting add well to new average well"Name it in the pop-up window and do the same for all individual wells to be grouped. Then check all average wells to confirm that all of them have the same initial conditions before the co-culture. In the experiment tab, press pause.Disconnect the instrument and take it out of the incubator. Then, remove the lids in the laminar flow hood. Subsequently, remove some of the medium from the insert at the upper well compartment.Add T cells to MBMECs by carefully pipetting 150 microliters of medium. Then, reconnect the instrument and press resume measurement. After 24 hours, press stop in the experiment tab and save the file.Shown here are the spindle-shaped morphology in the immunofluorescent staining of PECAM-1 and Cldn-5 five days after MBMEC isolation. Here are the TEER and Ccl values before and after grouping of individual wells prior to the addition of T cells. The blue curve is not used for the experiment since MBMECs in this well have not developed TEER as high as in other wells.In this experiment, mark 35 to 55 specific CD4 positive T cells were stimulated in an antigen-specific fashion for five days. Naive T cells and proinflammatory cytokines, interferon gamma and TNF-alpha served as a negative and positive control, respectively. Here, T cells were stimulated by the same amount of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies and the ones cultured for three days exhibited a greater propensity for barrier disruption compared to the T cells cultured for only two days.The results here show that stimulated T cells but not their supernatants caused a substantial damage to the MBMECs, indicating the direct contact between T cells and MBMECs is critical for barrier disruption. On the other hand, adding granzyme b inhibitor two to T cell culture restored MBMEC integrity to a greater extent, pointing to the cytolytic molecule as an important player in causing MBMEC damage and subsequent decrease in TEER Once mastered, this experiment can be done in 12 days if it's performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to choose the correct time point for setting up the co-culture of T cells and endothelial cells.Following this procedure other essays can be employed, such as immunofluorescence microscopy, flow cytometry, and probability essays. In order to address additional questions, such as How does this interaction affect tight junction molecule expression permeability and the extent of T cell transmigration? After its development, this technique paved a way for researchers in the field of neuroimmunology to explore autoimmune disorders of the CNS in mice.After watching this video, you should have a good idea of how to assess the direct effects between activated T cells and endothelial cells with regard to blood-brain barrier integrity and permeability.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro-analys för att utvärdera effekten av immunPathWays på HIV-specifika CD4 T-cell effektorfunktion

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell av en Oligodendrocyte styrt T-Cell Attack i akut hjärnan skivor

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Utveckling av ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modellsystem för att studera interaktionen mellan<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE med sin högaffinitetsreceptor FcsRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...