Name: subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Jeg takker Dr Vincent Seutin for hans konstant støtte, Chrisgillissen og Laurent Massotte for utmerket teknisk assistanse, Drs Jean Defourny og Sandra Ormenese for råd med konfokal mikroskop, Dr Jacques DESTINE for gaven av andre Axopatch 200B forsterker, GIGA-Imaging plattform for deling av konfokal mikroskop og Imaris programvare og Dr Stephen Freeman for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra de belgiske FRS - FNRS (U.N002.13 og T.N0015.13) og publisert med støtte fra den belgiske Universitetet Foundation (publie avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Forfatteren erklærer at han ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Denne rapporten beskriver en steg-for-steg-protokollen for å gjennomføre to somatodendritic hel-celle opptak og lokale dendrittiske opptak. Det er nyttig for å bestemme innvirkningen av ionekanaler (dvs. I h) på tidsforløpet av postsynaptiske potensialer og kartlegge fordelingen av ionekanalen (I h) langs somatodendritic domenet av nigral DA-neuroner, respektivt. Dannede elektrofysiologiske målinger kombineres for å legge hoc histokjemi å gjenopprette celle morfologi. Fremgangsmåten ble anvendt for å undersøke DA-nevroner lokalisert i substantia nigra, men kan generaliseres for nabo nigral GABA neuroner, ventrale tegmentale område DA-nevroner eller andre midthjernen nerveceller. Alle trinnene kan også følges for å undersøke andre ionekanaler uttrykt i dendritter av nigral nevroner uten viktige modifikasjoner. Post hoc visualisering er spesielt relevant for nevroner med axon bærendedendritter, for eksempel nigral nevroner 25,26, hippocampus Oriens-alveus interneurons 21 eller noen CA1 pyramidale nevroner 67. Interessant, nevroner som deler denne funksjonen ser ut til å være mer vanlig enn generelt antatt 67. Morfologisk analyse avslører også den nøyaktige plasseringen av elektrodene og axon. Påvisningen av den sistnevnte kan optimaliseres ved merking av proteiner uttrykt i axon innledende segment (spenningsstyrte Na + kanaler eller Ankyrin G) ved hjelp av immunhistokjemi 68,69. Påliteligheten av data innsamlet med dendrittiske opptak og påfølgende neuronal merking alltid avhenger av skive kvalitet. Maksimal innsats må derfor anvendes for å opprettholde levedyktigheten av celler i vevet. Dette oppnås med skånsom håndtering av friske dyr, høykvalitets verktøy og reagenser, tilstrekkelig oksygenering av vev og iskalde temperaturer gjennom utarbeidelse av skiver. Stabile opptaksforhold stole på valg av sunne nevroner. I det hel-celle-modus, bør seriemotstand i utgangspunktet være så lav som mulig og holdt konstant gjennom hele forsøket. Stabiliteten av opptakene er videre avhengig av høy kvalitet manipulatorer blottet for drift og vibrasjoner. Disse forstyrrelsene kan reduseres ved å optimalisere pipette stabilitet: kontrollerer forbindelsen til pipetten holderen og til heads, kontroll av at mikromanipulator kabler er slakk, unngå plutselige endringer i temperatur eller stadium bevegelse og kontroll av mekanismen av manipulatoren. For to innspillinger har methylsulfate 13,15,21 blitt inkludert i den intracellulære løsning, men gluconate 9,14,25 kan alternativt benyttes. Imidlertid kan hoved anion endre membranpotensialet 70,71 og noen spenningsavhengige strøm 72. Intracellulær løsning kan suppleres med ATP, GTP og fosfokreatin å bevare physiolobiologiske funksjoner av nerveceller. I tillegg, å tilsette et fluorescerende fargestoff i pipetten oppløsning (f.eks Alexa 594 eller sulforodamin 101 41) for å visualisere de dendritter i løpet av en somatisk opptak kan være nyttig for eksempel for å plassere en trykkpåvirkning (fig 7 i Ref. 41) eller en elektrisk stimulerende pipette. Pipetten løsningen for celle-festet opptakene inneholder en høy K + konsentrasjon og ingen Na + til å spille inn store jeg h. Verdt å merke seg den Na + / K + konsentrasjonsforholdet påvirker strømamplitude 10, reversering potensial på dagens 11 og portstyrings av I h 73. Alternativt kan jeg h også bli tatt opp med utenfor-outs 10. I dette opptaket konfigurasjon kan imidlertid den intracellulære miljøet i nærhet av kanalene bli forstyrret. Følgelig forskjeller i spenningsavhengige aktivering av I &lt;sub&gt; h observeres når en sammenligner strømninger innhentet ved hjelp av celle festet lapper og utenfor-outs 10. Hevelse av nerveceller er av og til oppstått i løpet av patch-clamp-opptak, og ofte oppstår fra forskjellige årsaker, for eksempel den lave kvalitet på vannet, sterk ubalanse i osmolaritet eller pH mellom intra- og ekstracellulære løsninger 39 eller feil i sammensetningen av løsninger. Kvaliteten på elektrofysiologiske opptak har en direkte virkning på kvaliteten av morfologien av gjenopprettede neuroner. Høy motstand somatiske pipetter brukes for dual opptak (6 - 10 Megohm, som i Refs 6,11.) Og for enkeltsomatiske opptak etter celle-festet opptak for å minimere utvanning av den intracellulære miljø 14. Hel-celle somatisk opptak følgende celle-tilknyttet opptaket er derfor holdes kort (&lt;10 minutter). Utenfor-out patcher fra både somatiske og dendrittiske pipetter er avgjørende for riktig lukking av cell membran og etterfølgende utvinning av cellemorfologi. I tillegg til cellens struktur, kan nevrokjemiske innhold bestemmes for de registrerte nevroner 59,74. For eksempel kan den intracellulære protein tyrosin hydroksylase bli immunolabeled for entydig identifikasjon av DA nevroner 13. DA-nevroner er hovedsakelig konsentrert i SN pars compacta, med en mye lavere tetthet som er tilstede i SN pars reticulata, hvor de blir blandet med et høyere antall GABA neuroner 75. Mens cellen kroppen av DA nevroner er ofte større enn for GABA nerveceller, er usikkert og delvis hindret av tettheten av Pars comp visuell identifisering av disse cellene med IR-videomicroscopy. For å omgå disse begrensningene, kan den forhåndsvalg av DA nevroner forenkles ved bruk av transgene mus som uttrykker en fluoriserende fargestoff i en bestemt populasjon av nerveceller (TH 65 eller DAT for DA nevroner, GADfor GABA nevroner) og epifluorescence belysning. Alternativt kan et fluoriserende fargestoff inngå i løsningen av somatiske elektroden for å lette visualiseringen av dendritter. Økt oppløsning av fluorescerende celle er brakt av Nipkow spinnende disk confocal 14,22,30 eller to-foton mikroskopi 7 kombineres til IR-DGC 6. Flere fordeler knytter seg til DGC i forhold til DIC. Først, som DIC prismer ikke er nødvendig, IR-DGC bilde kan overlappes med en fluorescens bilde 49,52,53,76. For det andre kan DGC kombineres med photostimulation og optogenetics 77. En ulempe ved fremstillingen skive er bevaring av integriteten av nerveceller. DA nevroner utvide sine dendritter i de tre romlige plan 78,79 og derfor avkutting av dendrittiske rommet ikke kan unngås helt i skiver 80. Valget av orienteringen av skiver (koronale, horisontal eller parasagittal) er en avveining. Opprinnelsen til innervasjon og eksperimentell design må anses å velge riktig orientering av skiver. Direkte dendrittiske patching er teknikken som brukes til å kartlegge fordelingen av funksjonelle ionekanaler i de forskjellige avdelinger av celler. I tillegg har denne teknikken gir for å bestemme variasjonen i funksjonelle egenskaper til kanalene 20. Som et supplement plassering og tetthet av ionekanaler kan fastslås ved hjelp av immunhistokjemi på lys og elektronisk mikros nivåer 17,23. Denne fremgangsmåten gir også mulighet for å bestemme den kanal tettheten i småkalibrede strukturer som er utilgjengelige for patch-pipetter. Men disse kanalene kan være i en tydelig funksjonell tilstand 24 eller inaktiv i forhold til de som er registrert med patch-clamp teknikker. Begge teknikkene er derfor nødvendig for å få et fullstendig bilde av plasseringen og egenskapene tilionekanaler i en bestemt cellulær region 17. Med utviklingen av spenningsfølsomme fargestoffer, har spenningen avbildning blitt brukt til å undersøke forplantning av APS og EPSP i nerveceller på flere steder 81. Som et alternativ til to patch-clamp-opptak, kan denne fremgangsmåten også bli implementert for tynne dendritter som ikke er tilgjengelige for patch-pipetter, men nødvendiggjør nøyaktig kalibrering av signalet og i snitt. Mens DA nevroner i SN og ventral tegmentale området er mye undersøkt via somatiske opptak i den fysiologiske og patofysiologiske sammenheng, funksjonelle egenskaper sine dendritter fortsatt i stor grad ukjent i begge forhold. Patching fra dendritter har blitt implementert for nigral dopamin nevroner av flere grupper med suksess 13,25,26 og er fortsatt den metoden for valg for å dissekere hissige egenskapene til disse fine subcellulære strukturer 8. Dendrittiske innspillinger gi en ytterligere opportuning til å granske effektivitet og plastisitet av synaptisk transmisjon og plastisitet av dendrittiske oppstemthet 82,83.

Nerveceller motta synaptiske informasjon hovedsakelig på sine dendritter. Eksitatoriske og hemmende synaptiske signaler spres fra deres side av generasjon til integrering nettsted hvor aksjonspotensialer (APS) er fremkalt som utgangssignalet. På sin vei, er synaptiske potensialer påvirket av både strukturen i dendritter og samspillet mellom passive og aktive membranegenskaper. Kombinasjonen av disse svært variable parametre utvider regnekraft av nerveceller 1,2. Imidlertid liten diameter av dendritter hindrer imidlertid studier av deres elektriske egenskaper. Den kontinuerlige utviklingen av patch-clamp teknikken 3, har optikk 4 og foredling av metoder for skive forberedelse 5 i løpet av de siste tiårene aktivert opptak fra svært tynn (0,7 til 3 mikrometer Ø) dendritter 6,7. Disse metodene var, og er, fortsatt i stor grad brukes til å undersøke excitability av dendritter i en rekke of nevroner 8. Direkte dendrittiske opptak er avgjørende for å bestemme fordelingen 9-19 og forskjeller i de funksjonelle egenskaper 20-22 av ionekanaler i forskjellige nevronale avdelinger. Disse dataene er nødvendig supplement av ionekanal distribusjoner oppdages med immunhistokjemi sammen til lys- og elektronmikroskopi 23,24. Dual somatodendritic innspillinger er iverksatt for å utforske utbredelsen av aksjonspotensialer 9,13-15,21,22,25-27 og spredning av synaptiske potensialer 13,16,18 langs somatodendritic domenet av nerveceller, få detaljerte passive kabel modeller 28- 30 og undersøke tidsoppløsningen av nevronale integrering 31. Substantia nigra (SN) er en region som ligger i midthjernen er involvert i flere funksjoner, som for eksempel kontroll av bevegelse, koding av belønning og fast atferd. Reduksjonen av dopamin på grunn av den spesifikketap av dopaminergiske (DA) neuroner i SN er forbundet med de motoriske forstyrrelser som observeres hos pasienter som lider av Parkinsons sykdom 32. Den nigral krets er sammensatt av to hovedcelletyper: dopaminerge og GABAergiske nevroner. Interessant, disse nevronene har flere spesifikke funksjoner som skiller dem fra andre nerveceller. Axon av en stor andel av DA nevroner og noen GABA nevroner stammer fra en dendrittiske nettstedet indikerer at dendrittiske arbor er heterogen (axon bærende og axon-mangler dendritter) 25,26,33. Morfologien av disse nevronene i kontrast derfor med den typisk organisering av neuroner i hvilken informasjonsoverføring følger loven om dynamisk polarisasjon som utsendes av Cajal: fra dendritter, til soma og til slutt til axon 34. DA-nevroner er også kjent for å frigjøre dopamin fra sine dendritter 35, generere sprengning aktivitet 36 og NMDA-reseptor-plastisitet 37. den dissecsjon av disse fenomenene er unnvikende uten direkte opptak fra stedet der de er igangsatt. For å få innsikt i forholdet mellom den nøyaktige beliggenheten og funksjonelle egenskaper av ionekanaler og deres rolle i dendrittiske oppstemthet og informasjonsoverføring i nigral nevroner, direkte dendrittiske innspillinger er metoden for valg. Denne rapporten beskriver en detaljert fremgangsmåte som kan anvendes for å oppnå enkle og doble patch-clamp opptak av dendritter av nigral nevroner og den tilsvarende post hoc biocytin merking. De grunnleggende prinsipper for patching den somatiske og dendrittiske membranen er svært like. Praktisk talt imidlertid opptak fra dendrittiske områder krever spesifikke optimalisering i forhold til somatiske opptak. Vellykket dendrittiske opptak stole på kvaliteten på skivene, optimal justering av optikken, skånsom tilnærming av oppdateringen pipette og stabilitet av opptakene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="137">
			<td height="137" style="height:138px;width:156px;">Double-distillated water</td>
			<td style="width:143px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Super Q</td>
			<td style="width:187px;">&#160;Resistivity &#62;14 M&#937; cm, ideal 18.2 M&#937; cm at 25&#176;C, filtered (0.22 &#181;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Microfilter candles</td>
			<td style="width:143px;">Robu</td>
			<td style="width:137px;">Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:156px;">Tissue slicer with vibroprobe</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:137px;">VT1200</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:143px;">Dosaka</td>
			<td style="width:137px;">DTK-1000</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 4, frequency 7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Razor blades</td>
			<td style="width:143px;">Gilette</td>
			<td style="width:137px;">Super Silver</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Reserve chamber</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">PP beckers</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">213-1725</td>
			<td style="width:187px;">400 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Merk Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Millex - GV 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:143px;">UHU</td>
			<td style="width:137px;">&#34;Sekunden Kleber&#34;</td>
			<td style="width:187px;">liquid glue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:137px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:137px;">1807524</td>
			<td style="width:187px;">2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dental wax</td>
			<td style="width:143px;">Colt&#232;ne/Whaledent</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">orthodontic tray wax strips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Platinum grid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:137px;">MF-830</td>
			<td style="width:187px;">to fire-polish pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:156px;">Potassium methyl sulfate</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:137px;">215481</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:156px;">Biocytin</td>
			<td style="width:143px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:137px;">B1592</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:156px;">Manometer</td>
			<td style="width:143px;">GREISINGER electronic</td>
			<td style="width:137px;">GDH 13 AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:156px;">Microscope</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:156px;">Dodt Gradient Contrast</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Manipulators</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">LN Mini 25</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:156px;">Frame grabber</td>
			<td style="width:143px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:137px;">DFG/USB2pro</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Camera</td>
			<td style="width:143px;">DAGE-MTI</td>
			<td style="width:137px;">NC-70</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Condenser</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">high numerical aperture condenser working with oil</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Objective</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td>
			<td style="width:187px;">63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Fourfold-changer</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">between the camera and the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Black &#38; white video monitor</td>
			<td style="width:143px;">Sony</td>
			<td style="width:137px;">SSM-175CE</td>
			<td style="width:187px;">16-inch, 850 TV lines, analog</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">215-2409</td>
			<td style="width:187px;">to transfer slices from the setup to histology room</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">The Axon Guide</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Book</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Stimfit</td>
			<td style="width:143px;">https://github.com/neurodroid/stimfit</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:156px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">441244</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:156px;">Well cell culture plate</td>
			<td style="width:143px;">Greiner-Bio-One</td>
			<td style="width:137px;">662160</td>
			<td style="width:187px;">for the staining of fixed slices</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:143px;">Merk</td>
			<td style="width:137px;">108643</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">mouse anti-TH monoclonal primary</td>
			<td style="width:143px;">Immunostar</td>
			<td style="width:137px;">22941</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11031</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:137px;">X0907</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">ProLong Diamond Antifade</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">P36961</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Fluorescein Avidin DCS</td>
			<td style="width:143px;">Vector Lab</td>
			<td style="width:137px;">A-2011</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:156px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:137px;">FV1000</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:156px;">ImageJ</td>
			<td style="width:143px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:143px;">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">plugin for ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Imaris</td>
			<td style="width:143px;">http://www.bitplane.com</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Neuromantic</td>
			<td style="width:143px;">http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:156px;">WinWCP</td>
			<td style="width:143px;">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendritter av dopaminerge nevroner motta og formidle synaptic innspill, støtte aksjonspotensial back-forplantning og frigjøring av nevrotransmittere. Forstå disse grunnleggende funksjonene vil belyse informasjonsoverføring i disse nevronene. Dendrittiske patch-clamp opptak gi mulighet til direkte å undersøke de elektriske egenskapene til dendritter og underliggende spenningsstyrte ionekanaler. Men disse fine strukturer er ikke lett tilgjengelig for patch pipetter grunn av sin lille diameter. Denne rapporten beskriver en trinn-for-trinn prosedyre for å samle stabil og pålitelig opptak fra dendritter av dopaminerge nevroner i akutte skiver. Elektrofysiologiske målinger kombineres med post hoc utvinning av cellemorfologi. Vellykkede forsøk er avhengige av forbedret fremstilling av skiver, løsninger og pipetter, tilstrekkelig justering av optikk og stabiliteten av pipetten i kontakt med den registrerte strukturen. Standard prinsipper Somatic patch-clamp opptak brukes til dendritter, men med en mildere tilnærming av pipetten. Disse allsidige teknikker kan implementeres for å håndtere ulike spørsmål som gjelder de hissige egenskapene dendritter.

Den ovenfor beskrevne protokollen har til hensikt å legge til rette for innsamling av data ved hjelp av dendrittiske patch-clamp opptak. Denne teknikken, kombinert med post hoc histokjemi, bidrar til å få innsikt i mekanismene for mange elektriske signaler som stammer eller sprer seg i dendritter. Direkte tilgang til dendritter med patch pipetter er vanskelig, men spesiell oppmerksomhet til flere metodiske aspektene vil øke suksessraten av opptakene. En eksperimentator tilstrekkelig erfaring i stabil somatiske opptak kan forvente å oppnå høy motstand (GΩ) pakningene og komplette eksperimenter på de fleste forsøk. En til to dendrittiske opptak av høy kvalitet kan samles per disseksjon. Tilgjengeligheten av høy kvalitet hjerneskiver som inneholder sunt somata og dendritter er en forutsetning for å få tilgang til disse fine strukturer (figur 1). den criterien for valg av disse nevronene er en glatt og homogen overflate over hele cellen og en soma og dendritter med lav kontrast når observert med optimale justert optikk (figur 1A og 1B). Valg av nevroner for sterkt kontrast generelt fører til ustabile opptak (figur 1C og 1C). Derfor er slike neuroner bør unngås. I forhold til andre nerveceller, nigral DA nevroner vise spesifikke morfologiske og elektrofysiologiske egenskaper. Disse funksjonene vanligvis vurderes med én somatisk pipette kan også observeres i dual somatisk (figur 2) og somatodendritic opptak (figur 3). Lange hyperpolariserer nåværende injeksjoner indusere en membranpotensialet utbedring kalt synke (Tall 2B og 5D). Axon stammer, i de fleste tilfeller på en dendritisk område som er identifisertved hjelp av komplementære kriterier 13,25,26, noe som indikerer at det dendritiske rommet i disse nevronene er heterogent (figur 3A - 3B). Som en konsekvens av kammeret hvor AP er observert første svarer til kammeret i hvilket aksonene fremkommer (figur 3C - 3D) 13,25,26. Axon er vanligvis avsluttet ved en aksonal bleb forårsaket av en skjæring av axon under kutting 64, men denne strukturen er ikke systematisk detektert. Den uttalt sag observert i nigral DA-nevroner påfølgende aktivering av Ih antyder en høy ekspresjon av HCN subenheter. For å bestemme påvirkning av jeg h på integrering av synaptiske signaler, ble synaptiske lignende strøm (EPSC) bølgeformer generert og injisert via dendrittiske innspillingen elektroden under somatodendritic dual opptak 55 (&lt;strong&gt; Figur 4). Kinetikken for disse simulerte EPSCs var basert på vekst og forfall tidskonstanter av ekte spontane EPSCs. Den resulterende aEPSP ble spilt inn med somatisk elektroden. Bath anvendelse av I-h blokker ZD 7288 økte varigheten av aEPSP, noe som indikerer at bidraget fra Ih til tidsforløpet av synaptiske signaler (figur 4B). ZD 7288 avskaffet også membranpotensialet utbedring som bekrefter at sag resultatene fra aktiveringen av I h (figur 4C). Resultatene oppnådd med simulerte EPSP resultatene kan være korrelert til eksperimenter som bruker elektrisk utløste EPSP 65. For å kartlegge nøyaktig fordeling av kanalen i somatodendritic domenet av DA nevroner, ble celle festet opptak implementert (figur 5). En høy motstand forsegling (&gt;&gt; 1 GΩ) er en absolutt nødvendighet for celle-festet opptak (figur 5B </strong&gt;). I dendritter av DA nevroner, aktiverer jeg h sakte med lange hyperpolariserer spenningstrinn og den nåværende steady-state oppnås etter hundrevis av ms (figur 5C), som tidligere vist 66. Denne observasjonen indikerer at HCN kanaler uttrykt i dendritter av DA-neuroner har forskjellige underenheter i forhold til de i pyramidale neuroner eller andre celletyper 10,16,66. Som fordelingen av kanalen kan være homogen i det dendritiske kammeret og som dendrittiske kammeret er i seg selv heterogen, blir identiteten av dendritt (axon-bærende eller nonaxon bærende dendritt) viste ved sammenligning av IR-DGC bilde med konfokalt bilde etter biocytin farging (figur 3A og B). Gjenoppretting av celle morfologi er derfor nødvendig for begge to somatodendritic innspillinger og for celle-festet opptak via påfølgende somatiske hel-celle opptak. Figur 1. Visualisere Soma og Proximal dendritter av Nigral dopaminerge nevroner bruker infrarød Videomicroscopy. (A) IR-DGC bilde av en nigral DA nevron viser soma og proksimale dendrite og både somatiske og dendrittiske pipetter. En dobbel somatodendritic opptaket ble vellykket utført på denne sunne neuron. Observer lav kontrast og den glatte overflate over hele somatodendritic domenet av cellen. (B) Et annet eksempel på en sunn DA neuron. (C) DA neuron med en grovere og ujevn overflate og en sterkere kontrast. Mens en dual opptak er oppnådd, stabiliteten var suboptimal, og varigheten på opptaket var kort (~ 15 min) på grunn av en gradvis økning av tilgangen motstand på begge pipetter. (D) Andre eksempel på en DA nevron som viser et sterkt kontrast soma og proksimale dendrite. I dette tilfelle ble en sterk økning av motstanden tilgangs observert kort tid etter bruddet i hel-celle-modus. Et forsøk på å minske tilgangen motstand ved undertrykk var mislykket. Nevroner i panel C og D kan ha blitt skadet under skjæreprosedyren, og bør unngås for eksperimenter. (E) samtidig dobbel somatisk opptak i en sunn DA neuron ved begynnelsen av opptaket. (F) Samme nevron som i panel E med en hoven celle kroppen etter ~ 17 min. Merk hele fravær av kontrast, ball-lignende utseende av soma og tilstedeværelsen av den store kjernen som ikke er synlig i friske nerveceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figur 2. </strong&gt; Samtidig Double Somatic Opptak fra et DA Neuron. (A) IR-DGC bilde under dobbel somatisk opptak fra et DA nevron. (B) Hyperpolarizing og depolariserende 1 s lange nåværende injeksjoner (-160 80 pA, øke 80 Pa) og tilsvarende spenningsendringer registreres samtidig med begge patch pipetter. Legg merke til tilstedeværelsen av sag i spennings spor med den lange Hyperpolarizing aktuelle trinnet og den store etter hyperpolarization etter AP under depolariserende strømpulsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figur 3. Dual S omatodendritic opptak i en DA Neuron. (A) IR-DGC bilde av en DA nevron. Avstanden mellom dendrittiske og somatic pipette er 29 mikrometer. (B) Confocal z-projeksjon bilde av nervecellen i panel A merket med avidin konjugert til fluorescein (FITC). Nervecellen ble fylt med biocytin under opptak. Axon stammer fra en proksimal dendritt nær soma som indikert ved pilen. (C) samtidig dual somatodendritic hel-cellespenning opptak fra neuron i panel A. AP registreres i soma (sort spenning spor) og dendritt (rød spenning spor) som reaksjon på en en s lang strøminjeksjon trinn via somatisk (venstre; solbær spor) og alternativt dendrittiske pipette (høyre; rød strøm trace) (D) Somatic og dendrittiske AP vist ved utvidet tidsskala.. Med enten somatisk eller dendrittiske nåværende injeksjon, den somatiske AP (svart) innledet dendrittiske AP (rød). Forsinkelsen mellom aksesspunkter i denne nervecellen var 120 ms og 210 ms med somatiske og dendrittiske nåværende injeksjon, henholdsvis. forsinkelserble målt til AP halvmaksimalt amplitude under den stigende fasen av AP. AP er observert først i kammeret i nærheten av hvilken det framgår axon, noe som bekrefter tidligere observasjoner 25,26. I dette tilfellet er det dendritiske opptak laget av et axon-mangler dendritt. Et eksempel på et opptak fra et akson bærende Dendritt er i Ref. 13 (i deres Fig. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figur 4. Utbredelse av Kunstige EPSP Langs Somatodendritic Axis of DA nerveceller. (A) IR-DGC bilde av en DA-neuron. Avstanden mellom dendrittiske og somatisk pipette er 45 mikrometer. Begge patch pipetter er i hel-celle strøm klemme opptaksmodus. (B) Currentregistrert med dendrittiske pipette i strøm-klemme og som brukes til å generere den kunstige EPSP (øverst). Strømmen blir oppnådd ved injeksjon av en EPSC-lignende bølgeform (ź stige = 0,6 ms; ź råte = 3 ms; amplitude = 100 pA) via den dendrittiske opptak pipetten 55. Nederst, spredte aEPSPs registrert på soma kontroll forhold (svart) og etter badet anvendelse av jeg h blocker ZD7288 (30 mikrometer; rød kurve). Hver spenning spor er gjennomsnittet av 40 enkeltrom sweeps. Legg merke til stor økning i EPSP varighet i nærvær av ZD7288 indikerer bidraget fra Ih til tidsforløpet av EPSP. (C) Spenning traser registrert fra soma i kontrollforhold (sort), og etter påføringen av 30 uM ZD 7288 ( rød) som reaksjon på en lang (30 pA; 1 s) Hyperpolarizing strømsprang. Legg merke til fraværet av membranpotensialet retting (SAG) etter blokkering av I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figur 5. Tilstedeværelse av jeg h i dendritter av DA Neuron. (A) IR-DGC bilde av en DA nevron og pipette på proksimale dendritt. (B) Kapasitive og lekkasjestrømmer i løpet av en fem spenning kommando mV i celle-festet konfigurasjon. Tetningen motstand var 5 GΩ i dette eksempel (C) Hyperpolarizing spenningstrinn. (90 mV; topp) fra en membranpotensialet fra 0 mV induserte en langsomt aktive I h. Den nåværende trase ble invertert og utstyrt med en enkelt eksponentiell funksjon som gir en tidskonstant av ź = 632 ms. (D) Spenningreaksjoner fra hele celle registrert soma (panel A) til en s hyper- og depolariserende strømpulser (-160 til 120 pA, 40 pA tilvekst). Somatiske hel-celle-opptak ble utført etter celle-tilknyttet opptaket. Legg merke til fraværet av aksesspunkter på grunn av den ekstracellulære anvendelse av TTX og Cd2 + for å undertrykke spontan avfyring i løpet av celle-tilknyttet opptaket. Disse spenningsstyrte Na + og Ca 2+ aktuelle blokkere ble lagt til undertrykke handling strømninger. Paneler A - D er fra samme nervecelle (E) IR-DIC bilde av en annen DA neuron og en dendrittisk pipette (F) Spenning-avhengige strømmer aktiveres av en testpuls til 0 mV fra en 50 ms prepulse ved -120 mV.. i en utenfor-out patch fjernet fra den proksimale dendrite av nervecellen i panelet E. Holding potensial -80 mV. Legg merke til tidsavhengige inaktivering av strømmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se et større</a>versjon av denne figuren. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stoff </td><td> g / mol </td><td> Konsentrasjon </td><td> i 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mm </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mm </td><td> 2,100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glukose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mm </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 1 mm </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 2 mm </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaritet: ~ 310 mOsmol / L (optimal rekkevidde: 314-325 mOsmol / l), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stoff </td><td> g / mol </td><td> Konsentrasjon </td><td> i 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mm </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 7 mm </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glukose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mm </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sukrose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mm </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,5 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaritet: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabell 2: Sukrose-ACSF for å fremstille skiver. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stoff </td><td> g / mol </td><td> Konsentrasjon </td><td> til 100 mL </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 mm </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mm </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 2 mm </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mm </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mm </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mm </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mm </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> Biocytin </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaritet: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 innstilt med KOH </td></tr></tbody></table> Tabell 3: Intracellulær løsning for to opptak. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stoff </td><td> g / mol </td><td> Konsentrasjon </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mm </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 2 mm </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (oppløsning) </td><td> 1 mm </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mm </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mm </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mm </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> bacl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mm </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mM </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mm </td><td> 200 nM </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaritet: ~ 290 mOsmol / L, justert med D-glukose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Elektrode løsning for celle-festet opptak.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulære Patch-klemme Opptak fra Somatodendritic Domain of Nigral dopaminneuroner

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings i Indre ørehår celler isolert fra sebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolering av sensoriske nevroner av<em&gt; Aplysia californica</em&gt; For Patch Clamp Recordings i glutamaterg Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings fra embryonale Sebrafisk Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-celle Patch-clamp Opptak fra Morphologically- og Neurochemically-identifiserte hippocampus interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Hele-celle Patch-klemmeopptak for elektrofysiologisk bestemmelse av ion selektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Anvendelse av automatisert bildestyrt patchklemme for studiet av nevroner i hjernesnitt

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Hypothalamus kisspeptin nevroner som et mål for helcelle patch-klemme opptak

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...