Name: methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors at JoVE.com

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. Att bedöma effekten av småmolekylinhibitorer på hinnan och Biofilm kolonibildning <ol><li> Bered en 2x lösning av definierade biofilm framkallande MSgg mediet 25 utan kalciumklorid och järn (III) klorid hexahydrat. Efter filtersterilisering, tillsätt kalciumklorid. Mediet är klar att använda direkt eller den kan lagras vid 4 ° C i mörker. </li><li> Förbered 1x MSgg utspädning på dagen för experimentet. <ol><li> Späd 2x MSgg mediet till 1x med sterilt destillerat vatten (pellicles) eller st...

Bacillus subtilis bildar robusta och mycket strukturerade biofilmer både i flytande (pellicles) och på fast medium (kolonier). Därför fungerar den som en idealisk modellorganism för att karaktärisera verkningsmekanismen för specifika biofilm hämmare. På fasta medier, celler bildar flercelliga strukturer med särdrag som inte är uppenbart i pellicles, som rynkor som strålar ut från centrum till kanten. Således pellicles och kolonier är kompletterande system för att studera B. subtilis fle...

Flercelliga bakteriesamhällen spelar viktiga roller i naturliga och antropogena miljöer, och kan vara till nytta eller mycket skadlig. Dessa flercelliga kolonier kallas biofilmer, varvid de enskilda cellerna är inbäddade i en egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) matris. EPS kraftigt vidhäfta cellerna till ytan de kolonisera. De fungerar som en sköld mot mekaniska och kemiska krafter och skapa en nära kontakt mellan angränsande celler, vilket underlättar cellulär kommunikation 1. En biofilm kan ses som ett differentierat samhälle, där celler använder starkt reglerad, iscensatt processer för att samordna sina insatser i samhället, liksom över arter 2-5. Övergången från ett plankton fritt levande läge för tillväxt till en biofilm tillstånd förknippas ofta med utvecklingsprocesser. Ett bra exempel är de grampositiva jordbakterien Bacillus subtilis och därför en undomesticated stam fungerar som en robust modellorganism för att studera utvecklingsstadier som leder till biofilmbildning. I denna bakterie, rörliga celler organiserar sig i iögonfallande flercelliga strukturer som utför specialiserade arbetsuppgifter 4. En grupp av celler, den matris producenterna utsöndrar exopolysackarider 6, den amyloidprotein Tasa 7,8, och ytan hydrofobicitet proteinet BslA 9,10; vilka alla deltar i sammansättningen av de EPS 11-13. Med tanke på överflödet av biofilmer i naturliga och antropogena nischer och den förmodade dödliga skador de kan orsaka, det finns ett trängande behov av att hitta sätt att förhindra deras bildning. Småmolekylinhibitorer kan underlätta upptäckten av nya regulatoriska vägar, enzymer och strukturella proteiner involverade i biofilmbildning, och därigenom främja insikter i komplexa processer av flercelliga gemenskap enheten. Som B. subtilis är en väl studerad modell för biofilmbildning 14,15, kan den användas för att utvärdera effekterna av olika biofilm hämmare. Denna studie behandlar fyra grundläggande metoder som är viktiga för att utvärdera svaret av biofilmer på småmolekylinhibitorer. För det första att se till att dessa hämmare har en biofilm-specifikt mål, är separationen av effekten på planktontillväxt från effekten på biofilm formation kritisk. De flesta antibakteriella medel målceller i deras plankton tillväxtfas, men molekyler som riktar sig mot biofilmen livsstil är sällsynta. Dessutom, eftersom molekyler som inte påverkar planktontillväxt är inte giftig, kan de minska selektionstryck gynnar antibiotikaresistenta mutanter 16. Till exempel när biofilmer behandlas med D-aminosyror eller vissa andra cellvägg störande molekyler, de antingen störs eller demonteras, men dessa inhibitorer endast milt påverkar planktontillväxt 12,17. Däremot många antibiotika dramatiskt försämra planktontillväxt, med little eller ingen effekt på bildning av biofilm 17. För det andra, är avgörande om upprättande av en konsekvent och robust experimentell ram för att studera effekten av små molekyler. Vi observerade att den aktiva koncentrationsområdet av småmolekylinhibitorer var känslig för de pre-odlingsbetingelser och i den experimentuppställning som används för att studera effekten av dessa småmolekylära inhibitorer. Olika rapporter, särskilt de som studerar B. subtilis, visade variationer i koncentrationsintervall vid vilket D-aminosyror hämmar bildningen av pellicles - de flytande bakteriella biofilmer 12,17-19. Resultaten som presenteras här tyder på att följande faktorer hänsyn till skillnader i den aktiva koncentrationsintervall: pre-odlingsbetingelser (logaritmisk 12,17 kontra sen stationär 20 tillväxtfas), tillväxtmediet som används i pre-odlingsbetingelser (rik, odefinierat [Luria Broth, LB] kontra definieras [natriumglutamat-glycerol, MSgg]), inokuleringen förhållandet och i synnerhet avlägsnandet av den pre-kulturmedium före ympning. Temperaturen av statisk hinna tillväxt visade en mindre viktig roll i aktivitetsintervallet för den lilla molekylen hämmaren D-leucin, en representativ D-aminosyra som används i denna studie. Slutligen, när de biofilmer behandlas med specifika biofilm inhibitorer, robusta och informativa metoder krävs för att karakterisera verkningarna av dessa inhibitorer på biofilm fitness. Här används två metoder för att självständigt karakteriserar effekten av småmolekylära inhibitorer beskrivs i detalj: (1) Effekten på enskilda celler inom en biofilm koloni och deras motståndskraft mot antimikrobiella medel. Celler i biofilmer är vanligtvis mer resistenta mot antibiotika jämfört med fritt levande bakterier 21-23. Även om detta fenomen är multifaktoriell, har förmåga EPS för att minska antibiotika penetration ofta betraktas som en tilltalande förklaring 24 </sup&gt;. Denna metod bedömer överlevnad förutbestämda biofilmceller efter exponering för antibakteriella ämnen. (2) Effekten på biofilmen koloni arkitektur, från det stora till det lilla skalan. Biofilm kolonier kännetecknas av sin tredimensionella struktur och närvaron av EPS. Med hjälp av svepelektronmikroskop, kan förändringar i cellmorfologi, biofilm koloni struktur och arkitektur och överflöd av EPS visualiseras från den stora (mm) till den lilla skalan (nm).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="897">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Luria Broth, Lennox</td>
			<td style="width:305px;">Difco</td>
			<td style="width:127px;">240230</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Merck, 203.30 g/mol&#160;</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride anhydrous</td>
			<td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td>
			<td>1311-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma, 197.91 g/mol</td>
			<td>31422-250G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iron(III) chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 270.30 g/mo)</td>
			<td>F2877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zinc chloride anhydrous&#160;</td>
			<td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td>
			<td>424592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma, 337.27 g/mol</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tryptophan</td>
			<td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma, 165.19 g/mol</td>
			<td>P5482-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Sigma, 119.12 g/mol</td>
			<td>T8625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol anhydrous</td>
			<td>Bio-Lab Itd</td>
			<td>712022300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamic acid monosodium salts hydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>G1626-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-leucine</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>855448-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol anhydrous</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">razor blade</td>
			<td>Eddison</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">circular cellulose filter papers</td>
			<td>Whatman, 90 mm</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMS, 16% in water</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium cacodylate</td>
			<td>Merck, 214.05 g/mol&#160;</td>
			<td>8.2067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride 2-hydrate</td>
			<td>Merck, 147.02 g/mol&#160;</td>
			<td>1172113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stub-aluminium mount</td>
			<td>EMS, sloted head</td>
			<td>75230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">carbon adhesive tape</td>
			<td>EMS</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker 37&#176;C</td>
			<td>New Brunswick Scientific Innowa42</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:301px;">Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td>
			<td>Branson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 30 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 23 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter System, 500 ml, polystyrene</td>
			<td>Cornig Incorporated</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S150 Sputter Coater&#160;</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPD 030 Critical Point Dryer</td>
			<td>BAL-TEC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Pellikeln-analysen är en metod för att studera de starkt reglerade och dynamiska processer av B. subtilis flercellighet. Förutom detta är pellikeln assay lämpad för att testa ett intervall av antingen pre-starter villkor eller små molekylära koncentrationer i en enda cell-kultur multidish platta i ett experiment. Emellertid B. subtilis hinna bildning är känslig för de pre-odlingsbetingelser (t.ex., tillväxtmedium av pre-kulturen och dess tillväxtfasen), inokuleringen förhållande...

Watch this Scientific Journal Video about Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors at JoVE.com

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metoder för att studera<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilmer som en modell för att karakterisera Small Molecule Biofilm hämmare

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Återkommande herpetisk stromal keratit hos möss, en modell för att studera mänskliga HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Experimentell infektion med<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Som modell för att studera värd Interferon-y Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intrakraniell Subarachnoidal rutten av infektion för undersöker roller av Streptococcus suis biofilmer i hjärnhinneinflammation i en musmodell för infektion

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...