Name: defining substrate specificities for lipase and phospholipase candidates
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المجلس الوطني للعلوم بحوث والتكنولوجيا والمكسيك (CONACYT والمكسيك) (82614، 153998، 253549، و178359 في INVESTIGACION CIENTIFICA باسيكا وكذلك 118 في INVESTIGACION أون Fronteras دي لا Ciencia) ومن المديرية العامة لل Asuntos دي الشخصية Académico-الجامعة الوطنية المستقلة بالمكسيك (DGAPA-UNAM، PAPIIT IN202616، IN203612).

1. استنساخ وبإفراط الهيكلية الجيني لالليباز وتوقع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) 14 وأليغنوكليوتيد محددة (الجدول 1) 15، تضخيم الجين (smc01003، smc00930، أو smc00171)، يتوقع أن رمز لالليباز أو...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).</li><li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipases+for+biotechnology.">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li><li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+lipids+in+membranes.">Functional roles of lipids in membranes.</a> Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).</li><li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity:+why+are+there+so+many+lipids?.">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?.</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li><li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine.">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li><li>Geiger, O., R&#246;hrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+(Sinorhizobium)+meliloti.">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li><li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides.">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li><li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation.">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li><li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids.">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li><li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patatin-like+proteins:+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria?.">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?.</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li><li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase.">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li><li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lipase+Engineering+Database:+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families.">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li><li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+continuing+developments+at+PROSITE.">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces.">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes.">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in Molecular Genetics. , (1972).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li><li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phosphorimager SI User&#180;s Guide. , (1994).</li><li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzymes: Third Edition. , (1979).</li><li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+characterization,+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin,+a+phospholipase+D+superfamily+member.">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li><li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis.">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li><li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome+profiling.">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , (2012).</li><li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics.">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li><li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+genomics:+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes.">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).</li><li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria.">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li></ol>

على مدى السنوات ال 20 الماضية، تم التسلسل جينومات العديد من الكائنات الحية وعلى الرغم من ثروة من البيانات تسلسل الجينوم قد ولدت، وتفسير وظيفي لا يزال متخلفا، وبالتالي يعيق فهمنا من وظيفة الجينوم. وغالبا ما تسند وظائف الجينات في الجينوم على أساس التشابه في الجينات وظي...

الدهون القائم على الجلسرين مثل triacylglycerols و(glycero) الفوسفورية تشكل مهمة وربما الطبقات الشحمية الأكثر شهرة 1. Triacylglycerols (العلامات) هي الدهون أو الزيوت، والتي تعمل عادة على نسبة الدهون في التخزين، وبالتالي كمصادر الطاقة والكربون المحتملة. الكلمات يمكن أن يتحلل من الليباز، والتي كثيرا ما يفرز من قبل الكائن الحي إنتاج الهضم الكلمات الخارجية وجعلها متاحة كمصدر للكربون. أيضا، يباسيس وقد درس على نطاق واسع خلال السنوات نظرا لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية الهامة. 2. نظرا لطبيعة محبة للجهتين وشكلها شبه اسطواني، (glycero) الفوسفورية خواص تشكيل غشاء وتشكل عادة مكونات شحمي الرئيسية للغشاء bilayered 3. في الكائنات الحية الدقيقة بسيطة، مثل البكتيريا القولونية، فقط ثلاثة متغيرات رئيس مجموعة كبيرة، phosphatidylglycerol (PG)، كارديوليين (CL)، وphosphatidواجهت ylethanolamine (PE)، على الرغم من واحد يجب أن يكون على علم بأن كل واحد منهم يمكن أن تكون بديلا مع عدد كبير من مختلف سلاسل أسيل الدهنية في التعطيل -1 أو -2 موقف SN مما أدى إلى عدد كبير من مختلف الأنواع الجزيئية 4 . قد يكون بكتيريا أخرى الفوسفورية أخرى بالإضافة أو بدلا من ذلك. على سبيل المثال، Sinorhizobium meliloti، بكتيريا التربة، والتي هي قادرة على تشكيل جذور العقيدات التعايش المثبتة للنيتروجين مع البرسيم البقوليات (الحجازي)، ويتضمن بالإضافة إلى المؤسسة العامة ثان فوسفورية zwitterionic، فسفاتيديل (PC) 5. أيضا، والدهون لا تحتوي على الفوسفور أو الجلسرين قد تكون محبة للجهتين وتشكل جزءا من الغشاء الخلوي. على سبيل المثال، على ظروف النمو، يحد من الفوسفور، في س. meliloti، يتم استبدال (glycero) الفوسفاتية إلى حد كبير من نسبة الدهون في غشاء التي لا تحتوي على الفوسفور، أي sulfolipids، والدهون الأورنيثين، وdiacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. في البكتيريا، ويتم تشكيل DGTS من مادة ال diacylglycerol (داج) في مسار من خطوتين 7 ولكن كان مصدر لتوليد داج غير واضح. وتشير التجارب نبض مطاردة الكمبيوتر قد تكون مقدمة لDGTS 8 و باستخدام المنهجية الموصوفة في هذه المخطوطة استطعنا تحديد فسفوليباز C (PlcP، SMc00171) التي يتم تشكيلها بموجب شروط تحد من الفوسفور والتي يمكن تحويل الكمبيوتر إلى داج وphosphocholine 8. وفي دراسة منفصلة، اكتشفنا أن مخلقة أسيل، لجنة الزراعة (FadD) متحولة -deficient س meliloti أو من الإشريكية القولونية تراكم الأحماض الدهنية الحرة عند دخول مرحلة ثابتة من 9 النمو. على الرغم من أن هذه الأحماض الدهنية يبدو أن تستمد من الدهون غشاء، المصدر الدقيق للأحماض الدهنية الحرة أو الانزيم (ق) تحريرهم لم تكن معروفة. مرة أخرى، وتوظيف الاستراتيجية الواردة في هذه المخطوطة، وهما 10 (الفوسفات) يباسيس مثل patatin (SMc00930 وSMc01003) التي ساهمت في تكوين الأحماض الدهنية الحرة في س. وتوقع meliloti 11. والمثير للدهشة، وتستخدم SMc01003 همرشولد الركيزة تحويله إلى monoacylglycerol وأخيرا الجلسرين والأحماض الدهنية الحرة 11. لذلك، SMc01003 هو الليباز داغ (DglA). ورغم أن عددا من الخوارزميات وجود للتنبؤ المحتملين (الفوسفات) يباسيس 12،13، وظيفتها دقيقة وغير معروفة عادة دور الفسيولوجية. نحن هنا الخطوط العريضة لبروتوكول، لاستنساخ وبإفراط توقع أو المحتملة (الفوسفات) الليباز. توضح هذه المخطوطة كيف المقايسات الإنزيم يمكن تطوير وتحسين ل(الفوسفات) الليباز overexpressed باستخدام ركائز اللونية الاصطناعية. نحن نقدم أمثلة كيف مع فحص انزيم الأمثل الحقيقية (الفوسفات) الليباز الركيزة يمكن أن يكون مصادفة، وكيف يمكن أن تثري هذه النتائج فهمنا للعلم وظائف الأعضاء الميكروبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9180-03</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9507-05</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9309-02</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32203</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bidistilled water</td>
			<td>&#160;ANY</td>
			<td>&#160;NA</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9535-02</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>ANY</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TY broth</td>
			<td>ANY</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2 H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1332-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8885</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipase A2 snake venom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0790</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipase C Clostridium perfingrens</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7633</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>07422AH</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl stearate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3627</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>61716</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl decanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0252</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl palmitate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N2752</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9876</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl octanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21742</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, sodium salt [1-14C]</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC084</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9224-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105547</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer UV/VIS Lambda 35</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 820 Phosphorimager</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>NA</td>
			<td>Photostimulable Luminescence scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>Radioactivity Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>ThermoSpectronic</td>
			<td>NA&#160;</td>
			<td>Breakage of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatography paper 3MM Chr</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030917</td>
			<td>TLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinorhizobium meliloti 1021our</td>
			<td>reference 34</td>
			<td></td>
			<td>studied strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69451</td>
			<td>protein expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET9a vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69431</td>
			<td>protein expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET17b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69663</td>
			<td>protein expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352057</td>
			<td>radiolabeling of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9135</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine, dipalmitoyl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6267</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-monopalmitin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1640</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining substrate specificities for lipase and phospholipase candidates

الكائنات الحية الدقيقة وتنتج مجموعة واسعة من (الفوسفات) الليباز التي تفرز من أجل جعل ركائز الخارجية المتاحة للكائن الحي. بدلا من ذلك، وغيرها (الفوسفات) يباسيس قد تترافق مع جسديا الكائن إنتاج يسبب دوران من الدهون الذاتية وأفسحت المجال لإعادة تشكيل الأغشية الخلوية في كثير من الأحيان. على الرغم من أن المحتملة (الفوسفات) يباسيس يمكن التنبؤ بها مع عدد من الخوارزميات عندما تسلسل الجين / بروتين متاح، وكثيرا ما لم يتم الحصول على دليل تجريبي من الأنشطة الإنزيمية والخصوصيات الركيزة، والوظائف الفسيولوجية المحتملة. توضح هذه المخطوطة وتعظيم الاستفادة من الظروف فحص لالمحتملين (الفوسفات) يباسيس مع خصوصيات الركيزة غير معروفة وكيفية توظيف هذه الظروف الأمثل في البحث عن الركيزة الطبيعية من (الفوسفات) الليباز منها. استخدام ركائز اللونية الاصطناعية، مثل المشتقات ص -nitrophenyl، قد تساعد على كشف قاصرالنشاط الأنزيمي لتوقع (الفوسفات) الليباز في ظل ظروف قياسية. وبعد أن واجه مثل هذه النشاط الأنزيمي البسيط و المعلمات متميزة لفحص انزيم يمكن أن تختلف من أجل الحصول على التحلل أكثر كفاءة من الركيزة الاصطناعية. بعد أن تحدد الظروف التي انزيم يعمل بشكل جيد، يجب أن يعاير مجموعة متنوعة من ركائز الطبيعية المحتملة لتدهورها، وهي العملية التي يمكن اتباعها توظيف أساليب الكروماتوغرافي متميزة. تعريف خصوصيات الركيزة للإنزيمات جديدة، غالبا ما يقدم فرضيات لدور الفسيولوجية المحتمل لهذه الإنزيمات، التي ثم يمكن اختبارها تجريبيا. وعقب هذه المبادئ التوجيهية، كنا قادرين على تحديد فسفوليباز C (SMc00171) التي تحط فسفاتيديل إلى phosphocholine ومادة ال diacylglycerol، في خطوة حاسمة لإعادة تشكيل الأغشية الموجودة في بكتيريا Sinorhizobium meliloti على شروط تحد من الفوسفور للنمو. لمدة توقع patatin-مثل فوسفوليباز (SMc00930 وSMc01003) من نفس الحي، ونحن يمكن إعادة تعريف خصوصيات الركيزة وتوضيح أن SMc01003 هو الليباز مادة ال diacylglycerol.

آخر من أجهزة الكمبيوتر الخاصة فسفوليباز C SMc00171 مع Bis- ص -nitrophenyl الفوسفات مقتطفات خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من E. القولونية BL21 (DE3) × pLysS، التي أعربت ...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates at JoVE.com

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

تحديد الركيزة الخصوصيات لالليباز وفسفوليباز المرشحين

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

The overall goal of this procedure is to accelerate the detection of physiological substrates for potential lipases and phosopholipases. This method can help answer key questions in the Entomology field, such as how phospholipases contribute to lipid remodeling in biological membranes. The main advantage of this technique is that the optimization of enzymatic activity and the search for the natural substrate for the enzyme can be performed independently.Though this method can provide insight into substrate specificity of bacterial lipases and phospholipases, it can also be modified to study hydrolases of any other model organisms. We first had the idea for this method when we searched for an enzyme activity that could degrade the intrinsic membrane lipid phosphatidylcholine inorhizobium meliloti. To prepare cell-free protein extracts, defrost bacterial cell suspensions and store them on ice.Then, pass the cell suspensions three times through a cold pressure cell at 20, 000 pounds per square inch. Remove the in-tact cells and cell debris by centrifugation at 5, 000 times g for 30 minutes, at four degrees Celsius. After centrifugation, prepare aliquots of 100 and 500 microliters from the supernatant for subsequent analysis.Set up the previously-optimized enzyme assay using the pipetting schemes tabulated in the text protocol. For an initial coverage of distinct enzyme activities, use artificial substrates that yield a colored product upon hydrolysis, such as para-nitrophenol or PNP derivatives. Follow the time course for an increase of absorbance at 405 nanometers, due to the formation of PNP in a spectrophotometer at 30 degrees Celsius over a five-minute period.Finally, perform calculations as described in the text protocol. For radio labeling of lipids, prepare an overnight pre-culture of an organism of interest in five milliliters of the desired culture medium and grow at 30 degrees Celsius. From the pre-culture, inoculate into 20 millimeters of fresh medium in a 100-millimeter culture flask, to obtain an initial optical density at 620 nanometers of 0.3 for the culture.Next, transfer a one-milliliter aliquot of the culture to a 14-milliliter sterile polystyrene round bottom tube under sterile conditions. Add one microcurie of 114 c acetate to the one-milliliter culture. Then, incubate the liquid culture under agitation at 30 degrees Celsius for a period of 24 hours.At the end of the incubation period, transfer the culture to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube and centrifuge at 12, 000 times g at room temperature for five minutes. Resuspend the pellet in 100 microliters of water. At this point, store the cell suspension at minus 20 degrees Celsius or immediately continue with the extraction of polar lipids.To perform the extraction of polar lipids, add 375 microliters of a two to one methanol to chloroform solution to the 100 microliters of aqueous cell suspension. Vortex the sample for 30 seconds before incubating for five minutes at room temperature. Following incubation, centrifuge for five minutes at 12, 000 times g at room temperature.Then, transfer the supernatant to a new 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Next, add 125 microliters of chloroform and 125 microliters of water to the supernatant. After vortexing for 30 seconds, centrifuge the sample for one minute at 12, 000 times g at room temperature.Transfer the lower chloroform phase to a fresh tube. Then, dry the solution with a stream of nitrogen gas. Dissolve the dried lipids in 100 microliters of chloroform to methanol solution.For separation of neutral polar lipids by thin layer chromatography, apply three microliter aliquots of the lipid samples, on a high performance thin-layer chromatography silica gel aluminum sheet, starting two centimeters from the edges of the plate. If multiple samples are analyzed in one-dimensional chromatography, keep a distance of at least 1.5 centimeters between the different sample application spots. Transfer the mobile phase to a TLC developing chamber, internally coated with chromatography paper.Cover with a glass plate to let the chamber saturate for 30 minutes. Transfer the HPTLC Silica Gel aluminum sheet with the dried lipid samples to the chamber. Allow the plate to develop for 30 minutes in a closed chamber before removing the plate.Then, let the solvents dry off in a flow hood for two hours. Once the developed TLC sheet is dry, incubate it with a photostimulable luminescence screen in a closed cassette for three days. Then, expose the incubated screen to a PSL scanner and acquire a virtual image of the separated radio-labeled lipids.To determine diacylglycerol, or DAG, lipase activity, first add 5, 000 CPM of 14 C-labeled DAG to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Also, add a solution of Triton X-100 to the tube and mix by vortex. Dry the solution under a stream of nitrogen.For a final 100 microliter assay, add Tris-HCl buffer, a sodium chloride solution, and bi-distilled water. Vortex for five seconds. Initiate the reaction by adding five microliters of enzyme to the solution.Incubate the solution at 30 degrees Celsius for four hours. Stop the reaction by the addition of 250 microliters of methanol and 125 microliters of chloroform, before extracting lipids as described earlier in this video. Proceed to analyze neutral polar lipids by 1DTLC and subsequent PSL imaging as before.Although the predicted phosopholipase SMc01003 shows activity with artificial para-nitrophenol acyl esters, the activity is only double or triple of the background activity present in cell-free extracts of Escherichia coli, in which no foreign gene had been expressed. This indicates that para-nitrophenyl acyl esters don't seem to be good substrates for SMc01003. Whereas cell-free extracts of E.Coli cannot degrade diacylglycerol, extracts of strains in which the predicted phospholipase, SMc01003, had been expressed, caused a degradation of diacylglycerol.Though SMc01003 was predicted to be a phospholipase, it is actually a diacylglycerol lipase that degrades diacylglycerol to monoacylglycerol and one fatty acid. It then degrades monoacylglycerol further to glycerol and another fatty acid. Once mastered, this technique can be done in a few weeks if it's performed properly.After watching this video, you should have a good understanding of how to optimize enzyme activities of lipases and phospholipases, and how to continue with the search for their physiological substrates. A crucial advantage of this procedure is that the optimization of the enzyme activity can be separated from the search for the natural enzyme substrate. Don't forget that working with organic solvents or radioactive substances can be extremely hazardous and the required precautions should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

والليزر السريع جس الطريقة يسهل تحديد غير الغازية وخالية الاتصال من الخواص الحرارية ورقة

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

التصور والتحديد الكمي للإشارات TGFβ/BMP/SMAD تحت ظروف إجهاد القص السائل المختلفة باستخدام القرب-الربط-المقايسة

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...