Name: defining substrate specificities for lipase and phospholipase candidates
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82.614, 153.998, 253.549 und 178.359 in Investigación Científica Básica sowie 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) und von Dirección General de unterstützt Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

1. Klon und überexprimiert Strukturgens für Prognostizierte Lipase <ol><li> Unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) 14 und spezifischen Oligonukleotiden (Tabelle 1) 15, zu amplifizieren , die das Gen von Interesse (smc01003, smc00930 oder smc00171), vorhergesagt für eine Lipase kodieren oder Phospholipase, aus der genomischen DNA des Wirtsorganismus (dh , S. meliloti). <ol><li> Einführung spezifischer Restriktionsstelle...

<ol>
	<li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).</li><li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipases+for+biotechnology.">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+continuing+developments+at+PROSITE.">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces.">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes.">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in Molecular Genetics. , (1972).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. 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Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li><li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis.">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li><li>Peppelenbosch, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).</li><li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria.">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li></ol>

In den letzten 20 Jahren haben die Genome vieler Organismen sequenziert worden, und obwohl eine Fülle von Daten Genomsequenz generiert wurde, ist funktionale Auslegung Rückstand und damit behindert unser Verständnis der Genomfunktion. Genfunktionen in Genomen basieren häufig auf Ähnlichkeit mit Genen bekannter Funktion oder Auftreten von konservierten Motive zugeordnet. Jedoch ist die genaue Funktion eines bestimmten Gens häufig nicht bekannt. Insbesondere vorhergesagte strukturelle Gene für Enzyme können nicht ...

Glycerol-basierten Lipiden wie Triglyceriden und (glycero) Phospholipide sind wichtige und wohl die bekanntesten Lipidklassen 1. Triacylglycerolen (TAGs) sind Fette oder Öle, die üblicherweise als Speicherlipiden funktionieren und daher als potentielle Energie und Kohlenstoffquellen. TAGs können durch Lipasen abgebaut werden, die häufig durch den produzierenden Organismus ausgeschieden werden externe TAGs zu verdauen und sie als Kohlenstoffquellen zur Verfügung zu stellen. Auch wurden Lipasen weit über die Jahre studiert aufgrund ihrer wichtigen biotechnologischen Anwendungen 2. Auf Grund ihrer amphiphilen Natur und ihrer nahezu zylindrischen Form, (glycero) Phospholipide weisen membranbildenden Eigenschaften und in der Regel die Hauptlipidkomponenten einer doppelschichtigen Membran 3 bilden. In einfachen Mikroorganismen wie dem Bakterium Escherichia coli, nur drei Hauptkopfgruppe Varianten, Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin (CL) und phosphatidylethanolamine (PE) angetroffen werden , obwohl man sich bewusst sein sollte , dass jeder von ihnen kann 4 mit einer beträchtlichen Anzahl unterschiedlicher Fettacylketten an der sn - 1 oder sn - 2 - Position, die zu einer großen Anzahl von verschiedenen molekularen Spezies ersetzt werden . Andere Bakterien könnten haben andere Phospholipide zusätzlich oder statt. Zum Beispiel Sinorhizobium meliloti, ein Bodenbakterium, das mit der Leguminosen Luzerne (Medicago sativa) , um eine Stickstoff-fixierenden Knöllchen Symbiose zu bilden, enthält zusätzlich zu PE ein zweites zwitterionisches Phospholipid, Phosphatidylcholin (PC) 5 in der Lage ist. Auch Lipide nicht, die Phosphor oder Glycerin können amphiphile und bilden einen Teil der Zellmembran sein. Beispielsweise von Phosphor beschränkende Wachstumsbedingungen in S. meliloti, (glycero) Phospholipide sind weitgehend durch Membranlipide ersetzt , die nicht Phosphor enthalten, dh Sulfolipide, Ornithin Lipide und diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. In Bakterien ist DGTS von Diacylglycerin (DAG) in einem zweistufigen Weg gebildet 7 , aber die Quelle für DAG Generation war nicht klar. Pulse-Chase - Experimente vorgeschlagen , dass PC ein Vorläufer für 8 DGTS sein könnte und mit Hilfe der Methodik in diesem Manuskript beschrieben wir eine Phospholipase C identifizieren konnte (PLCP, SMc00171) , die unter Phosphor einschränkenden Bedingungen gebildet wird , und die PC in DAG umwandeln und Phosphocholin 8. In einer separaten Studie entdeckten wir , dass eine Acyl-CoA - Synthetase (FADD) defizienten Mutante von S. meliloti oder von Escherichia coli freien Fettsäuren akkumuliert , wenn 9 stationären Wachstumsphase eintritt. Obwohl diese Fettsäuren schienen von Membranlipiden abgeleitet werden, die genaue Quelle für die freien Fettsäuren oder die Enzym (e) zu befreien, sie waren nicht bekannt. Auch in diesem Manuskript die Strategie skizziert den Einsatz, zwei Patatin-like 10 (phospho) Lipasen (SMc00930 und SMc01003), die zur Bildung von freien Fettsäuren in S. beigetragen meliloti 11 vorhergesagt wurden. Überraschenderweise verwendet SMc01003 DAG als Substrat Umwandlung in Monoacylglycerin und schließlich 11 Glycerin und freien Fettsäuren. Daher ist SMc01003 eine DAG-Lipase (DGLA). Obwohl eine Reihe von Algorithmen zur Vorhersage Potential (phospho) sind Lipasen 12,13, deren genaue Funktion und physiologische Rolle ist in der Regel nicht bekannt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, zu klonen und überexprimiert vorhergesagt oder Potential (phospho) Lipasen. Diese Handschrift wird erläutert, wie Enzymassays können unter Verwendung von künstlichen chromogene Substrate für die überexprimiert (phospho) Lipase entwickelt und optimiert werden. Wir liefern Beispiele, wie mit einem optimierten Enzymtest die reale (phospho) Lipasesubstrats begegnet werden kann und wie diese Erkenntnisse könnten unser Verständnis der mikrobiellen Physiologie bereichern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9180-03</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9507-05</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9309-02</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32203</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bidistilled water</td>
			<td>&#160;ANY</td>
			<td>&#160;NA</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9535-02</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>ANY</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>211705</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TY broth</td>
			<td>ANY</td>
			<td>NA</td>
			<td>Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2 H2O</td>
			<td>Baker</td>
			<td>1332-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8885</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipase A2 snake venom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0790</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospholipase C Clostridium perfingrens</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7633</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>07422AH</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl stearate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3627</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>61716</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl decanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0252</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl palmitate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N2752</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9876</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl octanoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21742</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, sodium salt [1-14C]</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC084</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9224-01</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105547</td>
			<td>TLC analysis &#38; Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer UV/VIS Lambda 35</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 820 Phosphorimager</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td>NA</td>
			<td>Photostimulable Luminescence scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Scintillation Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>Radioactivity Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>ThermoSpectronic</td>
			<td>NA&#160;</td>
			<td>Breakage of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromatography paper 3MM Chr</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030917</td>
			<td>TLC analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinorhizobium meliloti 1021our</td>
			<td>reference 34</td>
			<td></td>
			<td>studied strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69451</td>
			<td>protein expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET9a vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69431</td>
			<td>protein expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET17b vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69663</td>
			<td>protein expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352057</td>
			<td>radiolabeling of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td>Enzymatic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9135</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylcholine, dipalmitoyl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6267</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-&#945;-monopalmitin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1640</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0500</td>
			<td>lipid standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining substrate specificities for lipase and phospholipase candidates

Mikroorganismen produzieren ein breites Spektrum von (phospho) Lipasen, die um sezerniert werden für den Organismus externe Substrate zur Verfügung zu stellen. Alternativ können andere (phospho) Lipasen physikalisch mit dem produzierenden Organismus verursacht einen Umsatz von intrinsischen Lipiden assoziiert sein können und häufig zu einem Remodeling der Zellmembranen führt. Obwohl Potential (phospho) Lipasen mit einer Anzahl von Algorithmen vorhergesagt werden, wenn das Gen / Protein-Sequenz verfügbar ist, experimentelle Nachweis der Enzymaktivitäten, Substratspezifitäten, und potentielle physiologische Funktionen ist häufig nicht erhalten werden. Dieses Manuskript beschreibt die Optimierung der Testbedingungen für Interessenten (phospho) Lipasen mit unbekannten Substratspezifität und wie diese optimierten Bedingungen bei der Suche nach dem natürlichen Substrat eines jeweiligen (phospho) Lipase zu verwenden. Mit künstlichen chromogene Substrate, wie p - Nitrophenyl - Derivate, kann dazu beitragen , eine kleinere zu erkennenenzymatische Aktivität für eine vorhergesagte (phospho) Lipase unter Standardbedingungen. Eine solche geringfügige enzymatische Aktivität angetroffen wird, können die unterschiedlichen Parameter einer Enzymassay, um einen effizienteren Hydrolyse des künstlichen Substrat zu erhalten, variiert werden. Nachdem die Bedingungen arbeitet ein Enzym gut unter denen sie festgestellt haben, sollte eine Vielzahl von potentiellen natürlichen Substrate für deren Abbau getestet werden, ein Prozess, der verschiedene chromatographische Methoden gefolgt Einsatz werden können. Die Definition von Substratspezifitäten für neue Enzyme, liefert oft Hypothesen für eine mögliche physiologische Rolle dieser Enzyme, die dann experimentell überprüft werden kann. Nach diesen Richtlinien, konnten wir eine Phospholipase C (SMc00171) , die Phosphatidylcholin, für den Umbau von Membranen in dem Bakterium Sinorhizobium meliloti auf phosphor limitierenden Bedingungen des Wachstums in einem entscheidenden Schritt phosphocholin und Diacylglycerin verschlechtert zu identifizieren. Für zwei vorhergesagten patatin-wie Phospholipasen (SMc00930 und SMc01003) des gleichen Organismus, könnten wir ihre Substratspezifität neu zu definieren und zu klären, dass SMc01003 ein Diacylglycerol Lipase ist.

Aktivität von PC-spezifische Phospholipase C SMc00171 mit Bis- p - Nitrophenylphosphat Zellfreie Extrakte von E. erhalten coli BL21 (DE3) pLysS x, die smc00171 hatte ausgedrückt, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht bis- p - Nitrophenylphosphat Ester zu hydrolysieren, eine spektrophotometrische enzymatischen Assay unter Verwendun...

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Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

The overall goal of this procedure is to accelerate the detection of physiological substrates for potential lipases and phosopholipases. This method can help answer key questions in the Entomology field, such as how phospholipases contribute to lipid remodeling in biological membranes. The main advantage of this technique is that the optimization of enzymatic activity and the search for the natural substrate for the enzyme can be performed independently.Though this method can provide insight into substrate specificity of bacterial lipases and phospholipases, it can also be modified to study hydrolases of any other model organisms. We first had the idea for this method when we searched for an enzyme activity that could degrade the intrinsic membrane lipid phosphatidylcholine inorhizobium meliloti. To prepare cell-free protein extracts, defrost bacterial cell suspensions and store them on ice.Then, pass the cell suspensions three times through a cold pressure cell at 20, 000 pounds per square inch. Remove the in-tact cells and cell debris by centrifugation at 5, 000 times g for 30 minutes, at four degrees Celsius. After centrifugation, prepare aliquots of 100 and 500 microliters from the supernatant for subsequent analysis.Set up the previously-optimized enzyme assay using the pipetting schemes tabulated in the text protocol. For an initial coverage of distinct enzyme activities, use artificial substrates that yield a colored product upon hydrolysis, such as para-nitrophenol or PNP derivatives. Follow the time course for an increase of absorbance at 405 nanometers, due to the formation of PNP in a spectrophotometer at 30 degrees Celsius over a five-minute period.Finally, perform calculations as described in the text protocol. For radio labeling of lipids, prepare an overnight pre-culture of an organism of interest in five milliliters of the desired culture medium and grow at 30 degrees Celsius. From the pre-culture, inoculate into 20 millimeters of fresh medium in a 100-millimeter culture flask, to obtain an initial optical density at 620 nanometers of 0.3 for the culture.Next, transfer a one-milliliter aliquot of the culture to a 14-milliliter sterile polystyrene round bottom tube under sterile conditions. Add one microcurie of 114 c acetate to the one-milliliter culture. Then, incubate the liquid culture under agitation at 30 degrees Celsius for a period of 24 hours.At the end of the incubation period, transfer the culture to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube and centrifuge at 12, 000 times g at room temperature for five minutes. Resuspend the pellet in 100 microliters of water. At this point, store the cell suspension at minus 20 degrees Celsius or immediately continue with the extraction of polar lipids.To perform the extraction of polar lipids, add 375 microliters of a two to one methanol to chloroform solution to the 100 microliters of aqueous cell suspension. Vortex the sample for 30 seconds before incubating for five minutes at room temperature. Following incubation, centrifuge for five minutes at 12, 000 times g at room temperature.Then, transfer the supernatant to a new 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Next, add 125 microliters of chloroform and 125 microliters of water to the supernatant. After vortexing for 30 seconds, centrifuge the sample for one minute at 12, 000 times g at room temperature.Transfer the lower chloroform phase to a fresh tube. Then, dry the solution with a stream of nitrogen gas. Dissolve the dried lipids in 100 microliters of chloroform to methanol solution.For separation of neutral polar lipids by thin layer chromatography, apply three microliter aliquots of the lipid samples, on a high performance thin-layer chromatography silica gel aluminum sheet, starting two centimeters from the edges of the plate. If multiple samples are analyzed in one-dimensional chromatography, keep a distance of at least 1.5 centimeters between the different sample application spots. Transfer the mobile phase to a TLC developing chamber, internally coated with chromatography paper.Cover with a glass plate to let the chamber saturate for 30 minutes. Transfer the HPTLC Silica Gel aluminum sheet with the dried lipid samples to the chamber. Allow the plate to develop for 30 minutes in a closed chamber before removing the plate.Then, let the solvents dry off in a flow hood for two hours. Once the developed TLC sheet is dry, incubate it with a photostimulable luminescence screen in a closed cassette for three days. Then, expose the incubated screen to a PSL scanner and acquire a virtual image of the separated radio-labeled lipids.To determine diacylglycerol, or DAG, lipase activity, first add 5, 000 CPM of 14 C-labeled DAG to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Also, add a solution of Triton X-100 to the tube and mix by vortex. Dry the solution under a stream of nitrogen.For a final 100 microliter assay, add Tris-HCl buffer, a sodium chloride solution, and bi-distilled water. Vortex for five seconds. Initiate the reaction by adding five microliters of enzyme to the solution.Incubate the solution at 30 degrees Celsius for four hours. Stop the reaction by the addition of 250 microliters of methanol and 125 microliters of chloroform, before extracting lipids as described earlier in this video. Proceed to analyze neutral polar lipids by 1DTLC and subsequent PSL imaging as before.Although the predicted phosopholipase SMc01003 shows activity with artificial para-nitrophenol acyl esters, the activity is only double or triple of the background activity present in cell-free extracts of Escherichia coli, in which no foreign gene had been expressed. This indicates that para-nitrophenyl acyl esters don't seem to be good substrates for SMc01003. Whereas cell-free extracts of E.Coli cannot degrade diacylglycerol, extracts of strains in which the predicted phospholipase, SMc01003, had been expressed, caused a degradation of diacylglycerol.Though SMc01003 was predicted to be a phospholipase, it is actually a diacylglycerol lipase that degrades diacylglycerol to monoacylglycerol and one fatty acid. It then degrades monoacylglycerol further to glycerol and another fatty acid. Once mastered, this technique can be done in a few weeks if it's performed properly.After watching this video, you should have a good understanding of how to optimize enzyme activities of lipases and phospholipases, and how to continue with the search for their physiological substrates. A crucial advantage of this procedure is that the optimization of the enzyme activity can be separated from the search for the natural enzyme substrate. Don't forget that working with organic solvents or radioactive substances can be extremely hazardous and the required precautions should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Forschung

Biochemie

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Ein Rapid-Laser Probing Verfahren erleichtert die Nicht-invasive und berührungslose Bestimmung der Blatt Thermische Eigenschaften

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Erkennung von Phospholipase C Aktivität im Gehirn Homogenat von der Honigbiene

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...