Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra fonden Anna og Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. og Edla Johansson Foundation, den svenske Medical Research Council (give nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Cancer Foundation ved universitetet Hospital i Malmø, Physiographical samfund (Forssman's Foundation), og Skåne County Council Research og Development Foundation.

1. analyse af Vn som en bakteriel overflade Protein Ligand
<ol><li>
Påvisning af Vn-bindende på bakteriel overfladen ved hjælp af flowcytometri Bemærk: I flowcytometri, vi brugte side scatter og forward scatter til gate positive begivenheder. For at undersøge interaktioner med Vn, Hif kliniske isolater (n = 10)7 blev valgt sammen med E. coli BL21 (DE3) som en negativ kontrol (fig. 1A).<ol>
<li>Kultur Hif kliniske is...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

Bakterielle patogener rekruttere Vn til cellens overflade og udnytte dette supplement regulator for at undgå aflejring af supplement faktorer og færdiggørelse af membran angreb komplekse2. VN også fungerer som en bro molekyle mellem bakteriel overflade proteiner og vært celle overfladen receptorer, således at patogener til at holde sig til overfladen af epitelceller og efterfølgende formidle internalisering. I denne undersøgelse beskriver vi protokoller, der kan bruges til at anslå i) bin...

Vitronectin (Vn) er en vigtig menneskelige glycoprotein involveret i at opretholde homeostase via regulering af det fibrinolytiske system. VN også fungerer som et supplement regulator ved at hæmme terminal komplement pathway under C5b6-7 kompleks dannelse og C9 polymerisering. Flere bakterielle patogener har vist at rekruttere Vn til cellens overflade som et middel til at modstå supplement deposition1,2,3. Derudover fungerer Vn som en "sandwich" molekyle mellem bakterier og vært epitelcelle receptorer, dermed fremme overholdelse og internalisering af patogener2,4,5. Bindingen af Vn til bakteriel cellens overflade er medieret af andre i øjeblikket uidentificerede proteiner. Fuldt belyse Vn-bindingen i unddragelse af immunrespons slange funktionelle rolle vil derfor kræve identifikation af Vn-rekruttering proteiner.
Det første skridt i at identificere Vn-bindende proteiner er at teste, om en patogen interesse kan binde renset Vn. flowcytometri er en praktisk og enkel metode til at afgøre, om Vn er bundet til patogen celler. I denne undersøgelse vurderet vi bindingen af Vn til forskellige Haemophilus influenzae type f (Hif) kliniske isolater6. Den metode beskrevet heri er kvantitative og kan bruges til at skelne den bindende kapacitet af en bred vifte af bakterielle stammer. I en tidligere undersøgelse karakteriseret vi protein H (PH) i Hif som en Vn-bindende protein7. Derfor, i den nuværende undersøgelse, Vn-bindende potentialet i wild-type (WT) Hif og Hif M10Δlph mutanter blev sammenlignet ved hjælp af protokollerne beskrevet.
Når det er fastslået, at en patogen binder Vn, er det andet skridt at karakterisere overflade proteomet for at identificere potentielle Vn-bindende proteiner. En lang række metoder kan bruges til dette formål8,9, men disse metoder er ikke beskrevet i denne betænkning. Den metode, der er mest velegnet til at undersøge protein-protein interaktioner er recombinantly express udvalgte bakteriel overflade proteiner i E. coli og rense af affinitet kromatografi. Her bruger vi PH og dens molekylære interaktion med Vn for at illustrere metoden. Interaktioner mellem rekombinant PH og Vn var karakteriseret ved hjælp af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)7 og en nyligt udviklede etiket-gratis teknik kendt som bio-lag interferometri (BLI)10,11. Mens ringprøver kan bruges til at bekræfte protein-protein interaktioner, indeholder BLI detaljerede data om de kinetiske parametre af interaktioner.
For at studere Vn funktionelle rolle i bakteriel tilslutning, kan to forskellige assays udnyttes. Den første assay beskrevet her er direkte måling af bakteriel tilslutning til Vn-belagt glasoverflader, mens den anden analyse undersøger tilslutning til overfladen af epitelceller. For det første assay, glas dias var belagt med Vn, og bindingen af WT eller Hif mutantstammen blev vurderet af Gram-pletten og mikroskopi. Denne teknik adskiller let bakterier baseret på evnen til at binde Vn12. Bakteriel adhæsion til pattedyrceller blev derefter analyseret ved at tilføje kulturperler bakterier på en éncellelag af type II alveolær epitelceller; bakteriel vedhæftet fil blev vurderet ved at tælle antallet af kolonidannende enheder (CFUs). Overholdt og internaliseret bakterier kan skelnes i tilstedeværelse eller fravær af Vn4,13.
Rollen af Vn erhvervelse i bakteriel serum modstand blev evalueret ved hjælp af en serum drab assay (dvs., serum bakteriedræbende aktivitet). For at vurdere betydningen af Vn erhvervelse i serum modstand, var det bakteriedræbende aktivitet af Vn-forarmet serum (VDS) sammenlignet med normale humant serum (NHS). Metoden anvendes let adskiller Vn-bindende versus ikke-bindende bakterier baseret på serum modstand. Vi brugte denne metode til at studere Vn rolle i serum modstand på flere bakterielle patogener4,12.
Talrige metoder er blevet rapporteret til at studere vært-patogen interaktioner. Her, beskriver vi et sæt af protokoller, der kan tilpasses nemt til studiet af enhver patogen for at vurdere Vn rolle i patogenesen. Vi har testet disse protokoller ved hjælp af forskellige patogener, og Hif blev valgt som et eksempel for denne betænkning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

Bakterier udnytte supplement regulerende myndigheder som et middel til at unddrage sig vært immunresponset. Her beskriver vi protokoller for at vurdere den rolle vitronectin erhvervelse på bakteriel celle overflade spiller i modstand på vært immunsystemet. Flow flowcytometri eksperimenter identificeret humant plasma vitronectin som en ligand for bakteriel receptor ydre membran protein H af Haemophilus influenzae type f. En enzym-forbundet immunosorbent assay var ansat til at karakterisere protein-protein interaktioner mellem renset rekombinante protein H og vitronectin, og bindende affinitet blev vurderet ved hjælp af bio-lag interferometri. Den biologiske betydning af bindingen af vitronectin til protein H på bakteriel celleoverfladen i unddragelse af immunrespons vært blev bekræftet ved hjælp af en serum modstand assay med normale og vitronectin-forarmet humant serum. Betydningen af vitronectin i bakteriel tilslutning blev analyseret ved hjælp af glas lysbilleder, med og uden vitronectin belægning, efterfulgt af Gram farvning. Endelig, bakteriel adhæsion til menneskelige alveolær epitelcelle encellelag blev undersøgt. De protokoller er beskrevet her kan tilpasses nemt til studiet af enhver bakteriel arter af interesse.

VN-binding til overfladen af bakterier blev bestemt ved flowcytometri. Alle Hif kliniske isolater testet i denne undersøgelse rekrutteret Vn til cellens overflade. Ingen interaktion af Vn med cellens overflade blev observeret for E. coli negativ kontrol stamme (fig. 1A). Som vist i figur 1B, er PH en store Vn-bindende protein på overfladen af Hif celler. Binding af Vn ved WT Hif stamme...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Denne rapport beskriver protokoller for kendetegner interaktioner mellem bakteriel ydre Membranproteiner og menneskelige supplement regulator vitronectin. Protokollerne kan bruges til at studere den bindende reaktioner og biologiske funktion af vitronectin i enhver bakteriearter.

Assays til at studere rollen, som Vitronectin i bakteriel adhæsion og Serum modstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i vært-patogen interaktion felt såsom hvordan bakterielle patogener forårsage sygdom hos mennesker ved at udnytte menneskelige proteiner. Den største fordel ved denne teknik er det kan svare, hvis nogen patogen kan udnytte Vitronectin for oprettelse af infektion af værten. Vi vil fokusere på Vitronectin, et værtsprotein, der deltager i den ekstracellulære matrix, men fungerer også som et supplement hæmmer i determinant vej til komplement aktivering.Disse kendsgerninger er meget vigtige og meget attraktive for patogener forårsager sygdom hos mennesker. For at forberede flow cytometri, resuspend de bakterielle pellets med 50 mikroliter af blokerende buffer indeholdende 250 nanomolar Vitronectin. Derefter inkuberes prøverne i en time ved stuetemperatur uden at ryste.Efter inkubation, pellet bakterierne ved centrifugering ved 3, 500 g i fem minutter. Derefter vaskes pillerne tre gange ved hjælp af PBS og lignende centrifugeringstrin. Efter vask tilsættes 50 mikroliter af primære får antihumane Vitronectin polyklonale antistoffer til bakteriel pellet ved en 1 til 100 fortynding i PBS BSA.Suspensionen inkuberes i en time ved stuetemperatur. Derefter vaskes bakterierne tre gange med PBS for at fjerne ubundne antistoffer. Dernæst tilsættes 50 mikroliter PBS BSA indeholdende fluorescein isothiocyanat konjugeret æsel anti-får polyklonale antistoffer til pellet.Inkuber ved stuetemperatur i en time i mørke. Endelig, efter tre vasketrin, resuspend den bakterielle pellet med 300 mikroliter af PBS og analysere ved flow cytometri. For at forberede ELISA skal der dispenseres 100 mikroliter proteinopløsning i hver brønd på en PolySorp mikrotiterplade.Luk pladen med låget og opbevares ved fire grader Celsius natten over for at lette immobilisering af protein på microtiter plade brønde. Kassér opløsningen fra mikrotiterpladen ved at vippe på hovedet over vasken. Vask derefter brøndene tre gange med 300 mikroliter PBS pr. brønd.Bloker de belagte brønde i en time ved stuetemperatur med PBS, der indeholder 2,5 vægtvolumen procent BSA. Efter fjernelse af blokeringsopløsningen vaskes brøndene tre gange med 300 mikroliter PBST pr. brønd. Nu, tilføje 100 mikroliter af 50 nanomolar rekombinant hans-mærkede PH til hver prøve.I kontrolblydene tilsættes kun 100 mikroliter PBS BSA. Pladen inkuberes i en time ved stuetemperatur. Efter inkubation kasseres proteinopløsningen og fjernes de ubundne proteiner ved at vaske brøndene tre gange med 300 mikroliter PBST pr. brønd.Derefter tilsættes 100 mikroliter PBS BSA indeholdende peberrod peroxidase konjugeret anti-hans polyklonale antistoffer. Efter inkubering i en time ved stuetemperatur vaskes brøndene tre gange med 300 mikroliter PBST pr. brønd. Detekter antigen-antistofkomplekserne ved at tilsætte 100 mikroliter ELISA-detektionsreage til hver brønd.Derefter tilsættes 50 mikroliter af en molar svovlsyre per brønd for at stoppe reaktionen. Mål den optiske tæthed af brøndene ved 450 nanometer ved hjælp af en mikropladelæser. Immobilisere menneskelige Vitronectin på amin reaktive sensorer ved hjælp af amin kobling metode i henhold til producentens retningslinjer.Ved hjælp af PBS fortyndes den rekombinant PH-ligand serielt fra nul til fire mikromolar og de resulterende opløsninger overføres til en 96-brønd sort mikrotiterplade med flad bund. Kør eksperimentet ved 30 grader Celsius ved hjælp af et biolags interferometriinstrument. Pipette 10 mikroliter af en to mikrogram pr. milliliteropløsning af Vitronectin i PBS på et glasmikroskop dias som en enkelt dråbe.Lad dråben tørre på sliden i 30 minutter ved stuetemperatur. Det proteinbelagte glasglasser tre gange ved at dyppe dem i et bægerglas, der indeholder PBS i to sekunder, for at fjerne overskydende ubestrøget protein. Nu tilsættes 10 milliliter af en frisk Hif kultur i en steril plast petriskål og nedsænkes i belagt glas dias i kulturmediet.Inkuber retterne ved 37 grader Celsius i en time med rystelser ved 20 RPM. Efter inkubation fjernes eventuelle ubundne bakterier ved at nedsænke diasene tre gange i et bægerglas fyldt med PBS, før de visualiserer de bundne bakterier ved Gram-farvning som beskrevet i tekstprotokollen. Kultur A549 epitelceller som beskrevet i tekstprotokollen.Efter en vask og trypsinisering af cellerne ved 37 grader Celsius fortyndes cellesuspensionen til 5.000 celler pr. milliliter ved hjælp af komplet medium, der indeholder fem mikrogram pr. milliliter gentamycin. Forud for bakteriel infektion, erstatte mediet i brøndene med F12 medium og inkubere natten over ved 37 grader Celsius. Cellemonstræberen vaskes tre gange med en milliliter PBS ved stuetemperatur.Derefter placeres pladen på is og 200 mikroliter af forkølet F12-medium indeholdende 10 mikrogram pr. milliliter Vitronectin. Efter inkubation af pladen ved fire grader Celsius i en time kasseres opløsningen ved pipettering, og cellelaget vaskes to gange med en milliliter PBS ved stuetemperatur. Tilføj 100 mikroliter af frisk dyrket Hif vild type i F12 medium til hver brønd.Inkuber pladen i to timer ved 37 grader Celsius. Derefter aspirere mediet med en pipette og vask A549 epitelceller tre gange med PBS. Tilsæt 50 mikroliter pr. brønd af celleløsning og følg med en fem minutters inkubation ved 37 grader Celsius.Dernæst tilsættes 50 mikroliter af F12 komplet medium pr. brønd for at stoppe den enzymatiske reaktion. Overfør epitelcellerne fra hver brønd til et seks milliliterglas med fire glasperler. Lyse cellerne ved stuetemperatur ved vortexing i to minutter.Efter fortynding af cellen lysat 100-fold, plade 10 mikroliter af den fortyndede prøve på en chokolade agar plade. Tælle kolonierne efter en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius. At udføre analysen af Vitronectin-afhængig resistens over for bakteriedræbende aktivitet af humant serum, førstekultur og pellet bakterier som beskrevet i tekstprotokollen.Efter centrifugering, resuspend den bakterielle pellet med et volumen af Dextrose-Gelatine-Veronal buffer. Nu tilsættes 1, 500 CFU af bakterier til 100 mikroliter af DGVB plus indeholder 5% serum. Prøven inkuberes ved 37 grader Celsius i 15 minutter med omrystning ved 300 omdr./min.Fjern en 10 mikroliter aliquot fra reaktionsblandingen på nul minutter og 15 minutter. Placer aliquot på chokolade agar og inkubere pladen ved 37 grader Celsius natten over. Efter inkubation af chokolade agar plader, tælle kolonier, der er opført på pladerne og beregne procentdelen af bakterier dræbt som beskrevet i tekstprotokollen.Alle Hif kliniske isolater testet i denne undersøgelse rekrutteret Vitronectin til celleoverfladen som bestemt af flow cytometri. Binding af Vitronectin af den vilde type Hif stamme forårsaget et skift i populationen, mens mutanten ikke binder Vitronectin. Proteinproteininteraktioner mellem det vigtigste Vitronectin-bindende protein-PH og Vitronectin blev anslået af ELISA.Resultaterne indikerer et signifikant samspil mellem PH og både Vitronectin og den positive kontrol i forhold til den negative kontrol. Interaktion mellem PH og Vitronectin blev anslået i realtid ved hjælp af bio-lag interferometri at have en affinitet på 2,2 mikromolar. Desuden udviste bakterielle manglende udtryk for PH på celleoverfladen reduceret tilslutning til Vitronectin-belagte glasoverflader sammenlignet med vilde typeceller.Desuden forbedrede tilstedeværelsen af Vitronectin på overfladen af epitelceller signifikant overholdelsen af Hif. For at vurdere komplementhæmmende aktivitet af Vitronectin blev serummedieret drab undersøgt. Vilde type Hif-celler udviste højere serumbestandighed end mutantceller.Ingen bakterier blev dræbt i nærvær af varme-inaktiveret serum. Interessant, vilde type Hif udstillet reduceret overlevelse i Vitronectin-forarmet serum og genopfyldning af Vitronectin øget bakteriel overlevelse. Den mutante stamme reagerede imidlertid ikke på Vitronectin udtynding, fordi den ikke kunne rekruttere Vitronectin til celleoverfladen.Når mestrer, denne teknik kan det gøres i tre til fire dage for enhver patogen og husk at bruge den friske kultur af bakterielle patogener. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man analyserer Vitronectin binding til et patogen. Ud over denne teknik, Vitronectin bindende overflade proteiner af bakterier kan identificeres ved hjælp af proteomics og vestlige blotting.Denne teknik er vigtig for forskerne inden for værtspatogen interaktion og også at udforske mekanismen for virulens i bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En-dags Workflow ordningen for bakteriepatogen Detection og antimikrobiel resistens fra blodkulturer

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Static adhæsionsassayet for Studiet af Integrin Aktivering i T-lymfocytter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo model til at studere bakteriel adhæsion til karvæggen Under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

En multi godt Format polyacrylamid-baseret analyse for at undersøge effekten af ekstracellulære Matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hurtig, sikker og simpel manuel sengelamper nukleinsyre udvinding til påvisning af Virus i blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...