Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Foundation van Anna en Edwin Berger, Lars Hierta, de O.E. en Edla Johansson Foundation, de Zweedse Medical Research Council (verlenen van nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), de Stichting tegen kanker aan de Universiteit Ziekenhuis in Malmö, de Physiographical maatschappij (Forssman van Stichting), en de Skåne County Council van onderzoek en ontwikkeling Foundation.

1. analyse van de Vn als een bacteriële oppervlakte-proteïne-Ligand
<ol><li>
Detectie van Vn-inbinden op de bacteriële oppervlakte met behulp van stroom cytometry Opmerking: In stroom cytometry, we gewend kant scatter en voorwaartse scatter gate positieve gebeurtenissen. Onderzoek naar de interacties met de Vn, Hif klinische isolaten (n = 10)7 samen met E. coli BL21 werden geselecteerd (DE3) als een negatieve controle(Figuur 1...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

Bacteriële pathogenen Vn werven aan het celoppervlak en gebruik maken van deze aanvulling regulator om te voorkomen dat de afzetting van aanvulling factoren en de voltooiing van de membraan aanval complexe2. VN functioneert ook als een molecule van de brug tussen bacteriële oppervlakte-eiwitten en host cel oppervlakte receptoren, waardoor ziekteverwekkers te houden aan het oppervlak van epitheliale cellen en vervolgens bemiddelen internalisering. In deze studie beschrijven we protocollen die kun...

Vitronectin (Vn) is een belangrijke menselijke glycoproteïne die betrokken zijn bij het handhaven van de homeostase via regulering van het fibrinolytic systeem. VN functioneert ook als een regulator aanvulling door remming van de terminal complement pathway tijdens de complexvorming C5b6-7 en C9 polymerisatie. Verschillende bacteriële pathogenen hebben aangetoond dat het werven van de Vn aan het celoppervlak als een middel voor verzet tegen aanvulling afzetting1,2,3. Bovendien functioneert Vn als een "sandwich"-molecuul tussen bacteriën en host epitheliale cel receptoren, aldus bevordering van naleving en internalisering van ziekteverwekkers2,4,5. Binding van de Vn aan de oppervlakte van de bacteriële cel wordt gemedieerd door andere momenteel onbekend eiwitten. Volledig het ophelderen van de functionele rol van Vn-binding in ontduiking van de immuunrespons van de slang zal daarom identificatiegegevens van Vn-werven eiwitten nodig.
De eerste stap bij het identificeren van de Vn-bindende proteÃ¯nen is om te testen of een ziekteverwekker van belang gezuiverde Vn. stroom cytometry binden kunt is een handige en eenvoudige methode om te bepalen of de Vn is gebonden aan pathogen cellen. In deze studie beoordelen we de binding van de Vn aan verschillende Haemophilus influenzae type f (Hif) klinische isolaten6. De hier beschreven methode is kwantitatieve en kan worden gebruikt om te onderscheiden van de bindingscapaciteit van een breed scala van bacteriestammen. In een eerdere studie, we eiwit H (PH) van Hif gekenmerkt als een Vn-bindende eiwit7. Daarom, in de huidige studie, het Vn-bindende potentieel van wild-type (WT) Hif en Hif M10Δlph mutanten werden vergeleken met behulp van de beschreven protocollen.
Zodra vaststaat dat een ziekteverwekker Vn bindt, is de tweede stap te karakteriseren de oppervlakte Proteoom teneinde potentiële Vn-bindende proteÃ¯nen. Een aantal verschillende benaderingen kan worden gebruikt voor dit doel8,9, maar deze methoden zijn niet in dit verslag beschreven. De methode die het meest geschikt voor de behandeling van eiwit-eiwitinteractie is te recombinantly express geselecteerde bacteriële oppervlakte-eiwitten in E. coli en te zuiveren door chromatografie van de affiniteit. We gebruiken hier, PH en de moleculaire interactie met de Vn ter illustratie van de methode. Interacties tussen recombinante PH en Vn werden gekenmerkt met behulp van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 en een onlangs ontwikkelde, label-vrije techniek die bekend staat als bio-laag interferometrie (BLI)10,11. Overwegende dat de ELISAs kan worden gebruikt ter bevestiging van eiwit-eiwitinteractie, biedt BLI gedetailleerde gegevens met betrekking tot de kinetische parameters voor de afzonderlijke interacties.
De functionele rol van de Vn in de naleving van de bacteriële studeren, kunnen twee verschillende tests worden gebruikt. De eerste bepaling hier beschreven is rechtstreekse meting van bacteriële naleving van Vn-gecoate glazen oppervlakken, terwijl de tweede test aanhankelijkheid aan het oppervlak van epitheliale cellen onderzoekt. Voor de eerste assay, glas dia's waren bedekt met de Vn en de binding van WT of mutant Hif stammen werd beoordeeld door Gramkleuring en microscopie. Deze techniek onderscheidt gemakkelijk bacteriën op basis van het vermogen om te binden Vn12. Bacteriële hechting op zoogdiercellen werd vervolgens geanalyseerd door de toevoeging van de gekweekte bacteriën op een monolayer van type II alveolaire epitheliale cellen; bacteriële bijlage werd beoordeeld door het tellen van het aantal kolonie-vormende eenheden (CFUs). Zelfklevend en verinnerlijkte bacteriën kunnen worden onderscheiden in de aanwezigheid of afwezigheid van Vn4,13.
De rol van de acquisitie van de Vn in bacteriële serumresistentie werd geëvalueerd aan de hand van een serum doden assay (d.w.z., serum bactericide activiteit). Om de beoordeling van de omvang van de overname van de Vn in serumresistentie, werd de bactericide activiteit van Vn-verarmd serum (VDS) vergeleken met die van normale menselijk serum (NHS). De methode gebruikt gemakkelijk onderscheidt Vn-bindende versus niet-bindende bacteriën op basis van serumresistentie. Wij gebruikte deze methode om de rol van de Vn in de serumresistentie van verschillende bacteriële pathogenen4,12te bestuderen.
Tal van methoden zijn voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties gemeld. Hier beschrijven we een aantal protocollen die kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van eventuele pathogenen teneinde de rol van de Vn in de pathogenese. Wij testten deze protocollen met verschillende ziekteverwekkers, en Hif werd gekozen als een voorbeeld voor dit verslag.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

Aanvulling regelgevers bacteriën gebruiken als een middel om de immuunrespons van de gastheer te ontduiken. We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de overname van de vitronectin rol in de bacteriële cel oppervlakte speelt in verzet tegen het immuunsysteem van de gastheer. Stroom cytometry experimenten geïdentificeerd menselijk plasma vitronectin als ligand voor de bacteriële receptor buitenmembraan proteïne H van Haemophilus influenzae type f. Een enzym-verbonden immunosorbent analyse te karakteriseren van de eiwit-eiwit interacties tussen gezuiverde recombinante eiwitten H en vitronectin werkzaam was, en bindende affiniteit werd beoordeeld met behulp van bio-laag interferometrie. Het biologische belang van de binding van vitronectin aan proteïne H aan het oppervlak van de bacteriële cel in ontduiking van de immuunrespons van de gastheer werd bevestigd met behulp van een bepaling van de weerstand serum met normale en vitronectin-verarmd menselijk serum. Het belang van vitronectin in de naleving van de bacteriële werd geanalyseerd via glas dia's met en zonder vitronectin coating, gevolgd door de Gram-kleuring. Ten slotte, bacteriële hechting op menselijke alveolaire epitheliale cel monolayers werd onderzocht. De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk aangepast worden aan de studie van eventuele bacteriële soorten van belang.

VN-binding aan het oppervlak van bacteriën werd bepaald door stroom cytometry. Alle Hif klinische isolaten getest in deze studie aangeworven Vn aan het celoppervlak. Geen interactie van de Vn met het celoppervlak werd waargenomen voor de negatieve controlestam van E. coli (Figuur 1). Zoals blijkt uit Figuur 1B, is PH een belangrijke Vn-bindend-proteïne op het oppervlak van cellen van d...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Dit verslag beschrijft protocollen voor het karakteriseren van interacties tussen bacteriële buitenmembraan proteïnen en de menselijke aanvulling regelgever vitronectin. De protocollen kunnen worden gebruikt om de bindende reacties en biologische functie van vitronectin in elke bacteriesoorten te studeren.

Tests voor de bestudering van de rol van Vitronectin in bacteriële hechting en een Serum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in host-pathogen interactie veld, zoals hoe bacteriële ziekteverwekkers ziekte veroorzaken bij de mens door gebruik te maken van menselijke eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan beantwoorden als een ziekteverwekker Vitronectin kan gebruiken voor het vaststellen van infectie van de gastheer. We zullen ons richten op Vitronectin, een gastheereiwit dat deelneemt aan de extracellulaire matrix, maar ook functioneert als een complementremmer in determinant traject van complementactivering.Deze feiten zijn zeer belangrijk en zeer aantrekkelijk voor ziekteverwekkers die ziekte veroorzaken bij de mens. Ter voorbereiding op flow cytometrie, resuspend de bacteriële pellets met 50 microliters van het blokkeren buffer met 250 nanomolar Vitronectin. Vervolgens, incubeer de monsters voor een uur op kamertemperatuur zonder te schudden.Na incubatie, pellet de bacteriën door centrifugatie op 3, 500 g gedurende vijf minuten. Vervolgens, was de pellets drie keer met behulp van PBS en soortgelijke centrifugatie stappen. Voeg na het wassen 50 microliter primaire schapen antimenselijke Vitronectine polyklonale antilichamen toe aan de bacteriële pellet bij een verdunning van één tot 100 in PBS BSA.De vering een uur bij kamertemperatuur uitbroeden. Was vervolgens de bacteriën drie keer met PBS om niet-gebonden antilichamen te verwijderen. Voeg vervolgens 50 microliter PBS BSA toe met fluoresceïne isothiocyanaat geconjugeerde ezelanti-schapen polyklonale antilichamen aan de pellet.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur in het donker. Tot slot, na drie wasstappen, resuspend de bacteriële pellet met 300 microliters van PBS en analyseren door stroom cytometrie. Ter voorbereiding op ELISA, 100 microliter eiwitoplossing in elke put van een PolySorp microtiterplaat.Sluit de plaat met het deksel en bewaar 's nachts op vier graden Celsius om de immobilisatie van eiwitten op microtiterplaatputten te vergemakkelijken. Gooi de oplossing van de microtiterplaat door ondersteboven over de gootsteen te kantelen. Was vervolgens de putten drie keer met 300 microliter PBS per put.Blokkeer de gecoate putten gedurende een uur bij kamertemperatuur met PBS met 2,5 gewichtsvolumecent BSA. Na het verwijderen van de blokkeeroplossing, was de putten drie keer met 300 microliter PBST per put. Voeg nu 100 microliter van 50 nanomolar recombinant zijn-tagged PH aan elk monster.Voeg in de controleputten slechts 100 microliter pbs BSA toe. Broed de plaat een uur lang in bij kamertemperatuur. Na incubatie, gooi de eiwitoplossing weg en verwijder de niet-gebonden eiwitten door de putten drie keer te wassen met 300 microliters pbst per put.Voeg vervolgens 100 microliter PBS BSA toe met paardenradijsperoxidase geconjugeerde anti-zijn polyklonale antilichamen. Na het uitbroeden gedurende een uur bij kamertemperatuur, was de putten drie keer met 300 microliter PBST per put. Detecteer de antigeen-antilichaam complexen door het toevoegen van 100 microliter van ELISA detectie reagens aan elke put.Voeg vervolgens 50 microliters van één molair zwavelzuur per put toe om de reactie te stoppen. Meet de optische dichtheid van de putten op 450 nanometer met behulp van een microplatelezer. Immobiliseer menselijke Vitronectin op amine reactieve sensoren met behulp van de amine koppelingsmethode volgens de richtlijnen van de fabrikant.Met behulp van PBS verdun je de recombinant PH-ligand in serie van nul naar vier micromolar en breng je de resulterende oplossingen over naar een 96-goed zwarte flat-bottom microtiterplaat. Voer het experiment uit op 30 graden Celsius met behulp van een biolaag interferometrie-instrument. Pipette 10 microliters van een twee microgram per milliliter oplossing van Vitronectin in PBS op een glazen microscoop schuif als een enkele druppel.Laat de druppel 30 minuten drogen op de glijbaan bij kamertemperatuur. Was de glazen glijbanen met eiwit bedekte dia's drie keer door ze twee seconden in een beker met PBS te dompelen om overtollig ongecoat eiwit te verwijderen. Voeg nu 10 milliliter van een verse Hif-cultuur toe in een steriel plastic petrischaaltje en dompel de gecoate glazen platen onder in het kweekmedium.Incubeer de gerechten op 37 graden Celsius voor een uur met schudden op 20 RPM. Na incubatie, verwijder alle niet-gebonden bacteriën door het onderdompelen van de dia's drie keer in een beker gevuld met PBS voordat visualiseren van de gebonden bacteriën door Gram kleuring zoals beschreven in het tekstprotocol. Cultuur A549 epitheelcellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Verdun na één was- en trypsinisatie van de cellen bij 37 graden Celsius de celsuspensie tot 5.000 cellen per milliliter met behulp van een compleet medium met vijf microgram per milliliter gentamycine. Voorafgaand aan bacteriële infectie, vervang het medium in de putten met F12 medium en incubeer 's nachts op 37 graden Celsius. Was de celmonolaag drie keer met één milliliter PBS bij kamertemperatuur.Plaats vervolgens de plaat op ijs en 200 microliters van voorgekoeld F12-medium met 10 microgram per milliliter Vitronectin. Na het uitbroeden van de plaat op vier graden Celsius gedurende een uur, gooi de oplossing door pipetten en was de cellaag twee keer met een milliliter PBS bij kamertemperatuur. Voeg 100 microliters van vers geteelde Hif wild type in F12 medium aan elke put.Broed de plaat twee uur lang in bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens het medium aan met een pipet en was de A549 epitheelcellen drie keer met PBS. Voeg 50 microliter per put van celloslating oplossing en volg met een vijf minuten incubatie bij 37 graden Celsius.Voeg vervolgens 50 microliters F12 compleet medium per put toe om de enzymatische reactie te stoppen. Breng de epitheelcellen van elke put naar een zes milliliter glazen buis met vier glazen kralen. Lyse de cellen op kamertemperatuur door vortexing gedurende twee minuten.Na verdunning van het cellysaat 100-voudige, plaat 10 microliter van het verdunde monster op een chocolade agar plaat. Tel de kolonies na een nachtelijke incubatie op 37 graden Celsius. Om de analyse van Vitronectin-afhankelijke resistentie tegen de bactericide activiteit van menselijk serum uit te voeren, eerste cultuur en pellet de bacteriën zoals beschreven in het tekstprotocol.Na centrifugatie, resuspend de bacteriële pellet met een volume van Dextrose-Gelatine-Veronal buffer. Voeg nu 1,500 CFU bacteriën toe aan 100 microliter van DGVB plus plus plus met 5% serum. Incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten met schudden op 300 RPM.Verwijder een 10 microliter aliquot uit het reactiemengsel op nul minuten en 15 minuten. Plaats de aliquot op chocolade agar en incubeer de plaat op 37 graden Celsius 's nachts. Tel na incubatie van de chocoladeagarplaten de kolonies die op de platen verschijnen en bereken het percentage bacteriën dat is gedood zoals beschreven in het tekstprotocol.Alle Hif klinische isolaten getest in deze studie aangeworven Vitronectin aan het celoppervlak, zoals bepaald door flow cytometrie. Binding van Vitronectin door het wilde type Hif stam veroorzaakte een verschuiving in de bevolking, terwijl de mutant niet binden Vitronectin. Eiwit-eiwit interacties tussen de belangrijkste Vitronectine-bindende eiwit PH en Vitronectin werden geschat door ELISA.De resultaten wijzen op een significante interactie tussen PH en zowel Vitronectin als de positieve controle ten opzichte van de negatieve controle. De interactie tussen PH en Vitronectin werd in real-time geschat met behulp van biolaag interferometrie om een affiniteit van 2,2 micromolar te hebben. Bovendien vertoonde bacteriële niet-expressie van PH op het celoppervlak verminderde hechting aan vitronectin-gecoate glasoppervlakken in vergelijking met wildtypecellen.Bovendien verbeterde de aanwezigheid van Vitronectin op het oppervlak van epitheliale cellen de hechting van Hif aanzienlijk. Om de complementremmende activiteit van Vitronectin te schatten, werd serumgemedieerde moord onderzocht. Wild type Hif cellen vertoonden een hogere serumresistentie dan gemuteerde cellen.Er werden geen bacteriën gedood in aanwezigheid van warmte-geïnactiveerd serum. Interessant is dat wilde type Hif verminderde overleving vertoonde in vitronectin-uitgeput serum en aanvulling van Vitronectin verhoogde bacteriële overleving. De gemuteerde stam reageerde echter niet op Vitronectin-uitputting omdat het Vitronectin niet kon rekruteren op het celoppervlak.Eenmaal onder de knie, deze techniek kan worden gedaan in drie tot vier dagen voor elke ziekteverwekker en vergeet niet om de verse cultuur van de bacteriële pathogenen te gebruiken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben over hoe u de Vitronectin-binding aan een ziekteverwekker analyseren. Naast deze techniek kunnen Vitronectin bindende oppervlakteeiwitten van bacteriën worden geïdentificeerd met behulp van proteomics en western blotting.Deze techniek is belangrijk voor de onderzoekers op het gebied van gastheer-pathogene interactie en ook om het mechanisme van virulentie in bacteriën te verkennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...