Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione di Anna ed Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e fondamento di Edla Johansson, svedese Medical Research Council (concedere numero K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondazione di cancro all'Università Ospedale a Malmö, della società fisiografica (di Forssman Foundation) e del Consiglio della Contea di Skåne Fondazione ricerca e sviluppo.

1. analisi di Vn come ligando della proteina della superficie batterica
<ol><li>
Rilevamento di Vn-associazione sulla superficie batterica mediante citometria a flusso Nota: In citometria a flusso, abbiamo usato side scatter e forward scatter a cancello eventi positivi. Per esaminare le interazioni con Vn, gli isolati clinici di Hif (n = 10)7 sono stati selezionati insieme a e. coli BL21 (DE3) come controllo negativo (Figura 1A</...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

Batteri patogeni reclutano Vn alla superficie delle cellule e utilizzano questo regolatore di complemento per impedire la deposizione di fattori del complemento e completamento del complesso membrana attacco2. VN funziona anche come una molecola di ponte tra proteine di superficie batteriche e host recettori di superficie, consentendo in tal modo gli agenti patogeni di aderire alla superficie delle cellule epiteliali e successivamente mediare interiorizzazione. In questo studio, descriviamo i prot...

Vitronectina (Vn) è una glicoproteina umana importante coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi via il regolamento del sistema fibrinolitico. VN funziona anche come un regolatore di complemento inibendo la via di complemento terminale durante la formazione del complesso C5b6-7 e polimerizzazione C9. Parecchi agenti patogeni batterici sono stati indicati per reclutare Vn alla superficie delle cellule come mezzo di resistenza complemento deposizione1,2,3. Inoltre, Vn funziona come una molecola di "sandwich" tra batteri e recettori delle cellule epiteliali di host, quindi promuovere l'aderenza e interiorizzazione dei patogeni2,4,5. Associazione di Vn alla superficie delle cellule batteriche è mediata da altre proteine attualmente non identificati. Completamente delucidare il ruolo funzionale di Vn-associazione di evasione della risposta immunitaria tubo richiederà pertanto l'identificazione di proteine Vn-recruiting.
Il primo passo nell'identificazione di proteine che legano il Vn è per verificare se un agente patogeno di interesse possibile associare purificata Vn. flusso cytometry è un metodo pratico e semplice per determinare se Vn è associato a patogeni e cellule. In questo studio, abbiamo valutato l'associazione di Vn da vari Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolati clinici6. Il metodo qui descritto è quantitativo e può essere utilizzato per distinguere la capacità di legame di una grande varietà di ceppi batterici. In uno studio precedente, abbiamo caratterizzato la proteina H (PH) di Hif come Vn-legante della proteina7. Di conseguenza, nello studio presente, il potenziale di Vn-associazione dei mutanti di wild type (WT) Hif e Hif M10Δlph sono stati confrontati usando i protocolli descritti.
Una volta che è stato stabilito che un agente patogeno lega Vn, il secondo passo è di caratterizzare il proteoma di superficie al fine di identificare potenziali proteine che legano il Vn. Una varietà di approcci può essere utilizzata per questo scopo8,9, ma queste metodologie non sono descritti in questo rapporto. Il metodo più adatto per l'esame di interazioni proteina-proteina è recombinantly esprimere proteine di superficie batteriche selezionate in e. coli e purificare dalla cromatografia di affinità. Qui, usiamo il PH e la sua interazione molecolare con Vn per illustrare il metodo. Interazioni tra ricombinante PH e Vn sono state caratterizzate utilizzando un enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) l'analisi7 e una tecnica sviluppata di recente privo di etichetta, conosciuta come bio-strato interferometria (BLI)10,11. Mentre Elisa può essere utilizzata per confermare le interazioni proteina-proteina, BLI fornisce dati dettagliati per quanto riguarda i parametri cinetici delle interazioni.
Per studiare il ruolo funzionale di Vn in aderenza batterica, possono essere utilizzati due diversi saggi. Il primo test qui descritto è la misura diretta di aderenza batterica sulle superfici di vetro rivestite con Vn, mentre il secondo saggio esamina l'aderenza alla superficie delle cellule epiteliali. Per il primo test, lastre di vetro sono stati rivestiti con Vn, e l'associazione di WT o ceppi mutanti di Hif è stata valutata da microscopia e colorazione di Gram. Questa tecnica si distingue facilmente batteri basati sulla capacità di associare Vn12. Adesione batterica alle cellule dei mammiferi è stato quindi analizzato aggiungendo batteri coltivati su un monostrato di cellule epiteliali alveolari di II tipo; allegato batterica è stata valutata contando il numero di formazione di colonie (CFUs) unità. Aderito e interiorizzati batteri possono essere distinti in presenza o assenza di Vn4,13.
Il ruolo di acquisizione Vn in resistenza batterica del siero è stato valutato usando un'analisi di uccisione del siero (cioè, l'attività battericida del siero). Per valutare l'importanza di Vn acquisizione nella resistenza del siero, l'attività battericida del siero Vn-vuotati (VDS) è stata confrontata con quella di siero umano normale (NHS). Il metodo utilizzato prontamente distingue Vn-associazione contro batteri vincolanti basati sulla resistenza del siero. Abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo di Vn nella resistenza del siero di diversi batteri patogeni4,12.
Sono stati segnalati numerosi metodi per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Qui, descriviamo una serie di protocolli che possono essere facilmente adattate per lo studio di qualsiasi agente patogeno al fine di valutare il ruolo di Vn nella patogenesi. Abbiamo testato questi protocolli usando vari agenti patogeni, e Hif è stato scelto come esempio per questo report.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

I batteri utilizzare regolatori di complemento come mezzo per eludere la risposta immunitaria. Qui, descriviamo protocolli per valutare l'acquisizione di vitronectin ruolo presso i giochi di superficie delle cellule batteriche nella resistenza al sistema immunitario dell'ospite. Esperimenti di citometria a flusso identificato vitronectina plasmatica umana come un legante per la proteina della membrana esterna batterica del recettore H di Hemophilus influenzae tipo f. Un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente è stata impiegata per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra proteina ricombinante purificata H e vitronectina e affinità di legame è stata valutata mediante interferometria bio-strato. L'importanza biologica del legame di vitronectin alla proteina H alla superficie delle cellule batteriche di evasione della risposta immunitaria ospite è stata confermata usando un'analisi di resistenza di siero con siero umano normale e vitronectina-vuotati. L'importanza di vitronectin in aderenza batterica è stata analizzata utilizzando lastre di vetro con e senza rivestimento vitronectina, seguita dalla macchiatura di grammo. Infine, è stata studiata l'adesione batterica di monostrati di cellule epiteliali alveolari umane. I protocolli descritti qui possono essere facilmente adattati per lo studio di qualsiasi specie batteriche di interesse.

VN-si legano alla superficie dei batteri è stato determinato tramite flusso cytometry. Tutti Hif isolati clinici testati in questo studio ha reclutato Vn alla superficie delle cellule. Alcuna interazione di Vn con superficie delle cellule è stata osservata per il ceppo di controllo negativo Escherichia coli (Figura 1A). Come illustrato nella Figura 1B, PH è una proteina legante il Vn ...

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Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Questo rapporto descrive protocolli per caratterizzare le interazioni tra proteine della membrana esterna batterica e la vitronectina regolatore complemento umano. I protocolli possono essere utilizzati per studiare le reazioni di associazione e la funzione biologica di vitronectin in qualsiasi specie batteriche.

Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione ospite-patogeno come il modo in cui gli agenti patogeni batterici causano malattie nell'uomo utilizzando proteine umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può rispondere se qualsiasi agente patogeno può utilizzare vitronectina per stabilire l'infezione dell'ospite. Ci concentreremo sulla Vitronectina, una proteina ospite che prende parte alla matrice extracellulare, ma funziona anche come inibitore del complemento nella via determinante dell'attivazione del complemento.Questi fatti sono molto importanti e molto attraenti per gli agenti patogeni che causano malattie nell'uomo. Per prepararsi alla citometria del flusso, rimorsipare i pellet batterici con 50 microlitri di tampone di blocco contenente 250 vitronectina nanomolare. Quindi, incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente senza tremare.Dopo l'incubazione, pellet i batteri per centrifugazione a 3.500 g per cinque minuti. Quindi, lavare i pellet tre volte utilizzando PBS e passaggi di centrifugazione simili. Dopo il lavaggio, aggiungere 50 microlitri di anticorpi policlonali di vitronectina antiumani delle pecore primarie al pellet batterico a una diluizione da uno a 100 nel PBS BSA.Incubare la sospensione per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, lavare i batteri tre volte con PBS per rimuovere gli anticorpi non vincolati. Aggiungere quindi al pellet 50 microlitri di PBS BSA contenenti isotiocianato di fluoresceina anticorpi policlonali di asino coniugato.Incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio. Infine, dopo tre fasi di lavaggio, rimorsi il pellet batterico con 300 microlitri di PBS e analizzare per citometria a flusso. Per prepararsi a ELISA, erogare 100 microlitri di soluzione proteica in ogni pozzo di una piastra di microtitolo PolySorp.Chiudere la piastra con il coperchio e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte per facilitare l'immobilizzazione delle proteine sui pozzi della piastra del microtitolo. Scartare la soluzione dalla piastra del microtitoro inclinando a testa in giù sul lavandino. Quindi, lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBS per pozzo.Bloccare i pozzi rivestiti per un'ora a temperatura ambiente con PBS contenente 2,5 peso volume percento BSA. Dopo aver rimosso la soluzione di blocco, lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzo. Ora, aggiungete 100 microlitri di 50 nanomolari ricombinanti con PH con tag ad ogni campione.Nei pozzi di controllo aggiungere solo 100 microlitri di PBS BSA. Incubare il piatto per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione proteica e rimuovere le proteine non abbozzate lavando i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzo.Quindi, aggiungere 100 microlitri di PBS BSA contenenti perossidasi di ravanello di cavallo coniugato anticorpi anti-suo policlinico. Dopo aver incubato per un'ora a temperatura ambiente, lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzo. Rilevare i complessi antigene-anticorpi aggiungendo 100 microlitri di reagente di rilevamento ELISA ad ogni pozzo.Quindi, aggiungere 50 microlitri di un acido solforico molare per pozzo per fermare la reazione. Misurare la densità ottica dei pozzi a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastrine. Immobilizzare la vitronectina umana su sensori reattivi all'ammina utilizzando il metodo di accoppiamento delle ammine secondo le linee guida del produttore.Utilizzando PBS, diluire serialmente il ligando PH ricombinante da zero a quattro micromolari e trasferire le soluzioni risultanti su una piastra microtiter flat-bottom nera da 96 pozzetti. Esegui l'esperimento a 30 gradi Celsius usando uno strumento di interferometria a biostrato. Pipetta 10 microlitri di una soluzione di due microgrammi per millilitro di Vitronectin in PBS su un vetrino da microscopio in vetro come una singola goccia.Lasciare asciugare la goccia sullo scivolo per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetri rivestiti di proteine tre volte immergerli in un bicchiere contenente PBS per due secondi per rimuovere le proteine non rivestite in eccesso. Ora, aggiungere 10 millilitri di una coltura Hif fresca in una piastra di Petri di plastica sterile e immergere gli scivoli di vetro rivestiti nel mezzo di coltura.Incubare i piatti a 37 gradi Celsius per un'ora con tremori a 20 giri/min. Dopo l'incubazione, rimuovere eventuali batteri non legati immergendo le diapositive tre volte in un becher pieno di PBS prima di visualizzare i batteri legati mediante colorazione Gram come descritto nel protocollo di testo. Coltura A549 cellule epiteliali come descritto nel protocollo di testo.Dopo un lavaggio e tripsicinazione delle cellule a 37 gradi Celsius, diluire la sospensione cellulare a 5.000 cellule per millilitro utilizzando un mezzo completo contenente cinque microgrammi per millilitro di gentamicina. Prima dell'infezione batterica, sostituire il mezzo nei pozzi con mezzo F12 e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Lavare il monostrato cellulare tre volte con un millilitro di PBS a temperatura ambiente.Quindi, posizionare la piastra sul ghiaccio e 200 microlitri di mezzo F12 pre-refrigerato contenente 10 microgrammi per millilitro di Vitronectin. Dopo aver incubato la piastra a quattro gradi Celsius per un'ora, scartare la soluzione pipettando e lavare lo strato cellulare due volte con un millilitro di PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di tipo selvatico Hif appena coltivato in F12 medio ad ogni pozzo.Incubare il piatto per due ore a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare il mezzo con una pipetta e lavare le cellule epiteliali A549 tre volte con PBS. Aggiungere 50 microlitri per pozzo di soluzione di distacco cellulare e seguire con un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.Quindi, aggiungere 50 microlitri di F12 mezzo completo per pozzo per fermare la reazione enzimatica. Trasferire le cellule epiteliali da ogni pozzo a un tubo di vetro da sei millilitri contenente quattro perline di vetro. Lyse le cellule a temperatura ambiente vortice per due minuti.Dopo aver diluito il litorato cellulare di 100 volte, placcare 10 microlitri del campione diluito su un piatto di agar al cioccolato. Conta le colonie dopo un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Per eseguire l'analisi della resistenza vitronectina-dipendente all'attività battericida del siero umano, prima coltura e pellet i batteri come descritto nel protocollo di testo.Dopo la centrifugazione, rimescolare il pellet batterico con un volume di tampone destrosio-gelatina-veronale. Ora, aggiungi 1.500 CFU di batteri a 100 microlitri di DGVB più più contenente il 5% di siero. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti con scuotimento a 300 giri/min.Rimuovere un'aliquota di 10 microliter dalla miscela di reazione a zero minuti e 15 minuti. Posizionare l'aliquota sull'agar al cioccolato e incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione delle piastre di agar al cioccolato, contare le colonie che appaiono sulle piastre e calcolare la percentuale di batteri uccisi come descritto nel protocollo di testo.Tutti gli isolati clinici Hif testati in questo studio hanno reclutato Vitronectin sulla superficie cellulare come determinato dalla citometria del flusso. Il legame della vitronectina da parte del ceppo hif di tipo selvatico causò uno spostamento della popolazione mentre il mutante non legava la Vitronectina. Elisa ha stimato interazioni proteina-proteina tra la principale proteina legante vitronectina PH e Vitronectin.I risultati indicano un'interazione significativa tra PH e vitronectina e il controllo positivo rispetto al controllo negativo. L'interazione tra PH e Vitronectin è stata stimata in tempo reale usando l'interferometria a biostrato per avere un'affinità di 2,2 micromolare. Inoltre, la mancanza batterica di PH sulla superficie cellulare presentava una ridotta aderenza alle superfici di vetro rivestite di Vitronectin rispetto alle cellule di tipo selvatico.Inoltre, la presenza di Vitronectina sulla superficie delle cellule epiteliali ha migliorato significativamente l'aderenza di Hif. Per stimare l'attività di inibizione del complemento della Vitronectina, è stata esaminata l'uccisione mediata dal siero. Le cellule Hif di tipo selvaggio mostravano una maggiore resistenza al siero rispetto alle cellule mutanti.Nessun batterio è stato ucciso in presenza di siero inattivato dal calore. È interessante notare che hif di tipo selvatico ha mostrato una ridotta sopravvivenza nel siero impoverito di Vitronectin e il rifornimento di Vitronectin ha aumentato la sopravvivenza batterica. Tuttavia, il ceppo mutante non ha risposto all'esaurimento della vitronectina perché non poteva reclutare Vitronectin sulla superficie cellulare.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni per qualsiasi agente patogeno e ricordarsi di utilizzare la coltura fresca degli agenti patogeni batterici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come analizzare il legame della Vitronectin con un agente patogeno. Oltre a questa tecnica, le proteine superficiali leganti vitronectina dei batteri possono essere identificate usando la proteomica e l'gonfiore occidentale.Questa tecnica è importante per i ricercatori nel campo dell'interazione ospite-patogeno e anche per esplorare il meccanismo della virulenza nei batteri.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

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In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

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Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

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