Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

この作品は、アンナの財団とエドウィン ・ ベルガー、Lars Hierta、o. e.、Edla ・ ヨハンソン財団、スウェーデン医学研究評議会からの補助金によって支えられた (許可番号 K2015 57 X-03163-43-4、www.vr.se)、大学でがん財団マルメ ・家庭的社会 (性の基礎) とスコーネ郡評議会の研究・開発財団の病院。

1. 細菌の表面タンパク質のリガンドとしてベトナムの解析
<ol><li>
フローサイトメトリーを用いた細菌の表面で Vn 結合の検出 注意: フローサイトメトリーでを使用して前方散乱、側方散乱肯定的なイベントのゲートへ。Vn との相互作用を調べる Hif 臨床分離 (n = 10)エシェリヒア属大腸菌BL21 と共に選ばれた7 (DE3) (図 1A)...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

細菌性病原体は、細胞表面に Vn を募集し、補足物の要因の成膜および膜の攻撃の複合体2の完了を防ぐためにこの補完するレギュレータを利用します。Vn は、上皮細胞の表面に付着し、その後内面化を仲介する病原体ができ細菌の表面タンパク質とホスト細胞の表面の受容器、ブリッジの分子としても機能します。本研究では血清抵抗性および強化を提供する i) へのバイン?...

ビトロネクチン (Vn) は、線溶系の調節することによる恒常性の維持に関与する重要なひと糖です。Vn は 7 C5b6 複合体形成と C9 重合中に端末の補体経路を阻害することによって補完する調節因子としても機能します。いくつかの細菌性病原体は、抵抗補完沈着1,2,3の手段として細胞表面にヴァイオリンを募集する示されています。また、Vn は病原体2,4、5の内面化とホスト上皮細胞受容体、それによって促進付着細菌の「サンドイッチ」分子として機能します。Vn のバクテリアの細胞表面へのバインドは、他の現在正体不明の蛋白質によって媒介されます。完全にホースの免疫の回避で Vn バインディングの機能的役割の解明が必要になります (ヴァイオリン) 募集タンパク質の同定。
Vn 結合蛋白質を識別するに最初のステップは、関心の病原体は精製フローサイトメトリー ヴァイオリンをバインドできるかどうかをテストするのには、Vn が病原体のセルにバインドされているかどうかを決定するための便利で簡単な方法です。本研究では様々 なヘモフィルスタイプ f (Hif) 臨床分離株6の Vn の結合を評価しました。記載方法、定量細菌株の様々 の結合容量を区別するために使用することができます。以前の研究ではタンパク質 Hif の H (PH) を Vn 結合タンパク質7として特徴付けられます。したがって、本研究では野生型 (WT) Hif と Hif M10Δlphの突然変異体の Vn 結合のポテンシャルは、記述されていたプロトコルを用いて比較した.
Vn を病原体にバインドそれが決定されると、2 番目のステップは、潜在的な Vn 結合蛋白質を識別するために表面のプロテオームを特徴付けるためです。この目的8,9には、さまざまなアプローチを使用できますが、これらの方法論は、このレポートに記載されていません。Recombinantly大腸菌の選択した細菌の表面タンパク質の表現し、親和性クロマトグラフィーによる浄化する蛋白質蛋白質の相互作用を調べることに最も適した方法です。ここでは、メソッドを説明するために PH と Vn の分子相互作用を使用します。遺伝子組換えの PH とベトナム間の相互作用は、酵素免疫測定法 (ELISA)7とバイオ層干渉 (結合)10,11として知られている最近開発されたラベル無料手法を用いた特徴付けられました。Elisa は、タンパク質間相互作用を確認する使用ことができます、一方、バリは相互作用の速度論的パラメーターに関する詳細なデータを提供します。
細菌付着の Vn の機能的役割を勉強するには、2 つの異なるアッセイを利用できます。2 番目の分析検査上皮細胞の表面への付着に対し、ここで説明した最初の試金は Vn コーテッド ガラス表面の細菌付着の直接測定です。最初の試金のためスライド ガラスは、Vn でコーティングした、WT や Hif の突然変異系統のバインディングはグラム染色と顕微鏡で評価しました。この手法は、容易に Vn12をバインドする機能に基づく細菌を区別します。哺乳動物細胞への細菌の付着に II 型肺胞上皮細胞の単層培養菌を追加して分析しました。細菌付着がコロニー形成数を数えることによって評価されたユニット (CFUs)。付着、内面化された細菌は、Vn4,13の有無で区別できます。
Vn 細菌血清抵抗性獲得の役割は、(すなわち、血清殺菌) 血清殺害の試金を使用して評価しました。血清抵抗性で、Vn 買収の意義を評価するには、Vn 枯渇血清 (VDS) の殺菌活性は、正常ひと血清 (NHS) と比較した.容易に使用法は血清抵抗性に基づく拘束力のない細菌対 Vn バインディングを区別します。いくつかの細菌性病原体4,12の血清抵抗性の Vn の役割を研究するこのメソッドを使いました。
宿主-病原体相互作用を研究するための多数の方法を報告されています。ここでは、一連のすべての病原体の研究に Vn の病態での役割を評価するために簡単に合わせることができるプロトコルについて述べる。我々 は様々 な病原体を使用してこれらのプロトコルをテストし、Hif はこのレポートのための例として選ばれました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

細菌はホストの免疫反応を回避するための手段として補完するレギュレータを利用します。ここでは、ホストの免疫抵抗性の細菌の細胞の表面の再生の役割ビトロネクチン獲得を評価するためのプロトコルについて述べる。流れの cytometry の実験は、ヘモフィルスタイプ f の受容器の細菌外膜蛋白 H のリガンドとしてひと血漿ビトロネクチンを識別されます。酵素抗体法を用いて精製組換え蛋白質 H とビトロネクチン、蛋白質蛋白質の相互作用を特徴付けるし、バイオ層干渉法を用いて評価した結合親和性。正常およびビトロネクチン枯渇のひと血清で血清抵抗試金を使用してホストの免疫の回避の細菌の細胞表面タンパク質 H ビトロネクチンのバインディングの生物学的重要性を確認した.グラム染色に続いてビトロネクチン コーティングなしとスライド ガラスを使って細菌付着におけるビトロネクチンの重要性を調べた。最後に、ヒトの肺胞上皮細胞膜に細菌の付着を調べた。ここで説明されているプロトコルは興味の任意の細菌種の研究に容易に適応することができます。

細菌の表面に Vn バインディングは、フローサイトメトリーによって決定されました。すべて Hif 臨床分離株におけるテストは、細胞表面に Vn を採用しました。大腸菌陰性対照ひずみ (図 1A)、Vn 細胞表面との相互作用はみられませんでした。図 1Bに示すように、PH は表面 Hif 細胞の主要な Vn ?...

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Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

このレポートでは、細菌の外膜タンパク質とひと補体レギュレータ ビトロネクチンの相互作用を特徴付けるためのプロトコルについて説明します。この結合反応およびビトロネクチン値の任意の細菌種の生物学的機能を研究するプロトコルを使用できます。

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

この方法は、細菌病原体がヒトタンパク質を利用してヒトで病気を引き起こす方法など、宿主と病原体の相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、任意の病原体が宿主の感染を確立するためにビトロネクチンを利用できる場合に答えることができる。細胞外マトリックスに関与する宿主タンパク質であるビトロネクチンに焦点を当てるが、補体活性化の決定経路において補体阻害剤としても機能する。これらの事実は、ヒトの病気を引き起こす病原体にとって非常に重要であり、非常に魅力的です。フローサイトメトリーの準備のために、250ナノモルビトロネクチンを含むブロッキングバッファーの50マイクロリットルで細菌ペレットを再懸濁します。次いで、試料を振らず室温で1時間インキュベートする。インキュベーション後、3,500gで5分間の遠心分離により細菌をペレット化した。次いで、PBSおよび同様の遠心分離工程を用いてペレットを3回洗浄する。洗浄後、PBS BSAで1〜100希釈で細菌ペレットに50マイクロリットルの原生羊抗ヒトビトロネクチンポリクローナル抗体を加える。懸濁液を室温で1時間インキュベートする。次いで、PBSで細菌を3回洗浄し、非結合抗体を除去する。次に、フルオレセインイソチオシアネート結合ロバ抗羊ポリクローナル抗体をペレットに含むPBS BSAの50マイクロリットルを添加する。暗闇の中で1時間室温でインキュベートする。最後に、3回の洗浄工程の後、細菌ペレットを300マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。ELISAの準備のために、ポリソープマイクロテイタープレートの各ウェルにタンパク質溶液の100マイクロリットルを分配します。蓋でプレートを閉じ、マイクロタイタープレートウェルにタンパク質を固定化するために一晩摂氏4度で保管します。シンクの上に逆さまに傾けることによってマイクロティタープレートから溶液を捨てます。その後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSで3回井戸を洗います。2.5重量%BSAを含むPBSで室温で1時間コーティングされた井戸をブロックします。ブロッキング溶液を取り除いた後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗います。次に、10マイクロリットルの50ナノモル組換えPHを各サンプルに加えます。コントロールウェルには、PBS BSAの100マイクロリットルのみを追加します。プレートを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、タンパク質溶液を廃棄し、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去する。次いで、抗ヒスポリクローナル抗体をコンジュゲートした馬根ペルオキシダーゼを含有するPBS BSAの100マイクロリットルを添加する。室温で1時間インキュベートした後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗います。各ウェルに100マイクロリットルのELISA検出試薬を添加して抗原抗体複合体を検出します。次いで、反応を停止するためにウェルあたり1モル硫酸の50マイクロリットルを加える。マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルでウェルの光学密度を測定します。メーカーのガイドラインに従ってアミンカップリング法を使用して、アミン反応性センサーにヒトビトロネクチンを固定化します。PBSを使用して、組換えPHリガンドをゼロから4マイクロモルに連続して希釈し、得られた溶液を96ウェルブラックフラットボトムマイクロタイタープレートに移します。バイオ層干渉計装置を使用して、30°Cで実験を実行します。ピペット10マイクログラムの1ミリリットル/2マイクログラムのPBSで、ガラス顕微鏡スライド上に1滴としてスライドする。スライドの下に、室温で30分間乾燥させます。タンパク質コーティングされたガラススライドをPBSを含むビーカーに2秒間浸して3回洗浄し、過剰なコーティングされていないタンパク質を除去します。次に、新鮮なヒフ文化の10ミリリットルを無菌プラスチックペトリ皿に加え、コーティングされたガラススライドを培養液に沈めます。20 RPMで振って1時間摂氏37度で調理します。インキュベーション後、テキストプロトコルに記載されているようにグラム染色によって結合細菌を可視化する前にPBSで満たされたビーカーにスライドを3回浸すことによって、任意の結合されていない細菌を除去する。テキストプロトコルに記載されているように培養A549上皮細胞。1回の洗浄と細胞のトリプシン化を摂氏37度で行った後、1ミリリットル当たり5マイクログラムのゲンタマイシンを含む完全な培地を用いて、細胞懸濁液を1ミリリットル当たり5,000細胞に希釈する。細菌感染の前に、ウェル内の培地をF12培地に交換し、摂氏37度で一晩インキュベートする。細胞単層を室温で1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。次に、氷の上にプレートを置き、ビトロネクチンの1ミリリットル当たり10マイクログラムを含む予冷F12培地の200マイクロリットルを置きます。プレートを摂氏4度で1時間インキュベートした後、ピペット処理して溶液を捨て、室温で1ミリリットルのPBSで細胞層を2回洗浄します。各井戸にF12培地で成長したばかりのヒフ野生タイプの100マイクロリットルを追加します。プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。次いで、培地をピペットで吸引し、PbsでA549上皮細胞を3回洗浄する。細胞剥離液の井戸あたり50マイクロリットルを加え、摂氏37度で5分間のインキュベーションに従ってください。次に、F12完全培地を50マイクロリットルの完全な培地に加えて酵素反応を停止します。上皮細胞を各ウェルから4個のガラスビーズを含む6ミリリットルのガラスチューブに移します。室温で細胞を2分間渦を起分させる。細胞ライセートを100倍に希釈した後、10マイクロリットルの希釈したサンプルをチョコレート寒天板にプレートする。摂氏37度で一晩のインキュベーションに続いてコロニーを数えます。ヒト血清の殺菌活性に対するビトロネクチン依存性の解析を行うために、第一の培養およびペレットの細菌をテキストプロトコルに記載した。遠心分離後、デキストロースゼラチン-ベロナルバッファーの1つの体積で細菌ペレットを再懸濁します。次に、1,500 CFUの細菌をDGVBプラス5%血清を含む100マイクロリットルに加えます。300 RPMで振って15分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。反応混合物から10マイクロリットルのアリコートをゼロ分および15分で取り出す。チョコレート寒天にアリコートを置き、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。チョコレート寒天プレートのインキュベーション後、プレートに現れるコロニーを数え、テキストプロトコルに記載されているように殺された細菌の割合を計算する。この研究で試験されたすべてのHif臨床分離株は、フローサイトメトリーによって決定されるように細胞表面にビトロネクチンを募集した。野生型ヒフ株によるビトロネクチンの結合は集団のシフトを引き起こしたのに対し、変異体はビトロネクチンを結合しなかった。主要なビトロネクチン結合タンパク質PHとビトロネクチンとのタンパク質相互作用は、ELISAによって推定された。結果は、PHとビトロネクチンの両方と陰性対照に対する陽性対照との間の有意な相互作用を示す。PHとビトロネクチンの相互作用は、バイオ層干渉法を用いてリアルタイムで2.2マイクロモルの親和性を有すると推定された。さらに、細胞表面上のPHの発現不足の細菌は、野生型細胞と比較してビトロネクチン被覆ガラス表面への付着性を低下させた。さらに、上皮細胞の表面にビトロネクチンが存在すると、Hifの付着が著しく高まりました。ビトロネクチンの補体阻害活性を推定するために、血清媒介性殺死を検討した。野生型Hif細胞は変異細胞よりも高い血清抵抗性を示した。熱不活化血清の存在下で細菌は殺されなかった。興味深いことに、野生型ヒフはビトロネクチン枯渇血清中の生存率の低下を示し、ビトロネクチンの補充は細菌生存率を増加させた。しかし、変異株はビトロネクチンを細胞表面にリクルートできなかったため、ビトロネクチンの枯渇に反応しなかった。一度習得, この技術は、任意の病原体のために3〜4日で行うことができますし、細菌病原体の新鮮な培養を使用することを忘れないでください.このビデオを見た後, 病原体に結合ビトロネクチンを分析する方法についてよく理解している必要があります。.この技術に加えて、ビトロネクチン結合表面タンパク質の細菌は、プロテオミクスおよびウェスタンブロッティングを用いて同定することができる。この技術は、宿主と病原体の相互作用の分野の研究者にとって重要であり、また細菌の病原性のメカニズムを探求する。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...