Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Эта работа была поддержана гранты от фонда Анна и Эдвин Бергер, Ларс Hierta, о.е. и Эдла Йоханссон фонд, шведский Совет медицинских исследований (Грант номер K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Фонд рака в университете Больница в Мальмё, физиографические общества (Forssman в фонд) и Совет графства Сконе исследований и Фонд развития.

1. анализ Vn как лиганд бактериального белка на поверхности
<ol><li>
Обнаружение Vn-привязки на поверхности бактерий с помощью проточной цитометрии Примечание: В проточной цитометрии, мы использовали стороны точечной и вперед разброс для ворот позитивные события. Для изучения вз...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

Патогенные набирать Vn на поверхности клетки и использовать этот регулятор дополнением для предотвращения осаждения факторов комплемента и завершения комплекс мембраны нападение2. VN также функционирует как молекула мост между бактериальных белков на поверхности и прини?...

Vitronectin (Vn) является важным человека гликопротеин, участвующих в поддержании гомеостаза через регулирование фибринолитической системы. VN также функционирует как дополнение регулятор, подавляя терминала дополнением путь во время C5b6-7 комплекс формирования и C9 полимеризации. Было показано несколько бактериальных патогенов набирать Vn на поверхности клеток как средство противодействия дополнением осаждения1,2,3. Кроме того Vn функционирует как «сэндвич» молекула между бактериями и принимающих рецепторы эпителиальных клеток, способствуя присоединению и интернализации патогенов2,4,5. Связывание Vn к поверхности бактериальной клетки при посредничестве других в настоящее время неопознанные белков. Полностью определить функциональную роль Vn привязки в уклонение шланг иммунного ответа поэтому потребует идентификации Vn Рекрутинг белков.
Первым шагом в выявлении Vn связывающих белков является для тестирования ли возбудитель интереса можно привязать очищенный В.н. проточной цитометрии удобный и простой метод, чтобы определить, привязан ли Vn возбудителя клетки. В этом исследовании мы оценивали привязки Vn различных клинических изолятов Haemophilus influenzae типа f (Hif)6. Метод, описанный здесь количественных и может использоваться для различения связывающая способность широкого спектра бактериальных штаммов. В предыдущем исследовании мы охарактеризовал белка H (рН) Hif как Vn связывания белка7. Таким образом в настоящем исследовании, Vn привязки потенциал одичал тип (WT) Hif и Hif M10ΔЛПХ мутанты были сопоставлены с использованием описанных протоколов.
После того, как выясняется, что возбудитель связывает Vn, второй шаг должен характеризовать поверхности протеома с целью выявления потенциальных Vn связывающих белков. Различные подходы могут быть использованы для этой цели8,9, но эти методологии не описаны в настоящем докладе. Метод, наиболее подходящий для изучения взаимодействия протеин протеина является recombinantly выразить выбранный бактериальных белков на поверхности в E. coli и очищают хромотографией сродства. Здесь мы используем PH и ее молекулярного взаимодействия с Vn проиллюстрировать метод. Взаимодействие между рекомбинантных PH и ВН были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)7 и недавно разработанных лейбл свободный метод, известный как био слоя интерферометрии (BLI)10,11. В то время как ELISAs может использоваться для подтверждения белок белковых взаимодействий, BLI предоставляет подробные данные относительно кинетические параметры взаимодействия.
Для изучения функциональной роли Vn бактериальных соблюдения, могут быть использованы два разных анализов. Первая проба, описанные здесь является прямое измерение бактериальной присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностей, в то время как второй assay рассматривает присоединение к поверхности эпителиальных клеток. Для первого assay стекло слайды были покрыты Vn, и связывание WT или мутантных штаммов Hif оценивали по Граму и микроскопии. Этот метод легко различает бактерии, основанный на способности связать Vn12. Бактериальной адгезии клеток млекопитающих затем анализируется путем добавления искусственного бактерий на монослое типа II альвеолярных клеток эпителия; Бактериальные вложение оценивалась путем подсчета количества формирования колонии единиц (CFUs). Соблюдаться и интернализированных бактерии могут быть выделены в наличие или отсутствие Vn4,13.
Роль Vn приобретения в бактериальных сыворотки сопротивление было оцениваются с помощью пробирного убийство сыворотки (то есть, бактерицидную активность сыворотки). Чтобы оценить значение Vn приобретения в сыворотке сопротивления, бактерицидная активность сыворотки, Vn истощены (VDS) был по сравнению с нормальной человеческой сыворотки (NHS). Метод, используемый легко отличает Vn привязки против обязательной бактерий на основе сыворотки сопротивления. Мы использовали этот метод для изучения роли Vn в сыворотке сопротивление ряда бактериальных патогенов4,12.
Были зарегистрированы многочисленные методы для изучения взаимодействия хост патогена. Здесь мы описывают набор протоколов, которые могут быть легко адаптированы к изучению любых возбудитель для того, чтобы оценить роль в патогенезе Vn. Мы проверили эти протоколы, используя различные патогенные микроорганизмы, и Hif была выбрана в качестве примера для этого отчета.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

Бактерии использовать дополнение регуляторы в качестве средства уклонения от иммунного ответа. Здесь мы описываем протоколы для оценки роли vitronectin приобретения в бактериальной клетке поверхности играет в сопротивление иммунной системы. Потока цитометрии эксперименты определены человеческой плазмы vitronectin как лиганд для белка наружной мембраны бактерий рецептор H Haemophilus influenzae типа f. Энзим соединенный assay иммуносорбента был нанят характеризовать белок белковых взаимодействий между очищенной рекомбинантных белков H и vitronectin, и обязательного соответствия была оценена с помощью био слоя интерферометрии. Биологическое значение привязки vitronectin белка H на поверхности бактериальных клеток в уклонение иммунного ответа было подтверждено с помощью пробирного сопротивления сыворотки с нормальным и vitronectin истощены человеческой сыворотки. Значение vitronectin в бактериальных присоединения был проанализирован с использованием стекла слайды с и без vitronectin покрытия, следуют грамм пятная. Наконец бактериальной адгезии клеток человека альвеолярного эпителия монослои было расследовано. Протоколы, описанные здесь может быть легко адаптирована к изучению любых бактериальных видов интерес.

VN привязки к поверхности бактерий определяется проточной цитометрии. Все Hif клинических изолятов испытания в этом исследовании набраны Vn на поверхности клеток. Не взаимодействие Vn с поверхности клеток наблюдалось отрицательного контроля штамм E. coli (р...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

В настоящем докладе описываются протоколы для характеризующие взаимодействия между бактериальной внешней мембранных белков и vitronectin регулятор человека дополнением. Протоколы могут использоваться для изучения реакции связывания и биологические функции vitronectin в любых бактериальных видов.

Анализы для изучения роли Vitronectin в бактериальной адгезии и сопротивление сыворотки

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хозяина и патогена, такие как, как бактериальные патогены вызывают болезни у людей, используя человеческие белки. Основным преимуществом этого метода является он может ответить, если любой патоген может использовать Витронектин для установления инфекции хозяина. Мы сосредоточимся на Vitronectin, принимающий белок, который принимает участие во внеклеточной матрицы, но и функции в качестве ингибитора дополнения в детерминантный путь активации дополнения.Эти факты очень важны и очень привлекательны для патогенных микроорганизмов, вызывающих болезни у людей. Чтобы подготовиться к цитометрии потока, повторно потекут бактериальные гранулы с 50 микролитров блокирующего буфера, содержащего 250 наномолярных витронектин. Затем инкубировать образцы в течение одного часа при комнатной температуре без тряски.После инкубации, гранулы бактерий центрифугации на 3500 г в течение пяти минут. Затем, мыть гранулы три раза с помощью PBS и аналогичные шаги центрифугации. После мытья добавьте 50 микролитров первичных овец антигуманных витронектиновых поликлональных антител к бактериальным гранулам при разбавлении от одного до 100 в PBS BSA.Инкубировать подвеску в течение одного часа при комнатной температуре. Затем, мыть бактерии три раза с PBS, чтобы удалить несвехие антитела. Далее добавьте 50 микролитров PBS BSA, содержащих флуоресцеин изотиоцианат конъюгированных ослов против овец поликлональных антител к грануле.Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. Наконец, после трех шагов стирки, повторно бактериальные гранулы с 300 микролитров PBS и анализировать по потоку цитометрии. Чтобы подготовиться к ELISA, выпределите 100 микролитров белкового раствора в каждую колодец пластины микротитров PolySorp.Закройте пластину крышкой и храните при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы облегчить иммобилизацию белка на колодцы микротитровых пластин. Отбросьте раствор из пластины микротитр, наклонив вверх дном над раковиной. Затем, мыть скважины три раза с 300 микролитров PBS на скважину.Заблокив покрытые колодцы в течение одного часа при комнатной температуре с PBS, содержащим 2,5 процента веса BSA. После удаления блокирующего раствора, мыть скважины три раза с 300 микролитров PBST на скважину. Теперь добавьте к каждому образцу 100 микролитров по 50 наномолярных рекомбинантных его тегами PH.В контрольные скважины добавьте только 100 микролитров PBS BSA. Инкубировать тарелку в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации отбросьте белковый раствор и удалите несыполненные белки, промыв скважины три раза с помощью 300 микролитров PBST на скважину.Затем добавьте 100 микролитров PBS BSA, содержащих пероксидос хрена, конъюгированных анти-его поликлональных антител. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре, мыть колодцы три раза с 300 микролитров PBST на скважину. Обнаружить антиген-антитела комплексов, добавив 100 микролитров реагента обнаружения ELISA в каждой хорошо.Затем добавьте 50 микролитров одной молярной серной кислоты на колодец, чтобы остановить реакцию. Измерьте оптическую плотность скважин на уровне 450 нанометров с помощью микропластиного считыватель. Обездвижить человека Витронектин на амин реактивных датчиков с использованием метода соединения амина в соответствии с руководящими принципами производителя.Используя PBS, последовательно разбавляйте рекомбинантный ЛИганд PH от нуля до четырех микромолеров и перенесите полученные растворы на 96-ну черную пластину микротитров с плоским дном. Запустите эксперимент при 30 градусах цельсия с помощью биослойного интерферометрии инструмента. Пипетт 10 микролитров по два микрограмма на миллилитр раствора виронектина в PBS на слайде стеклянного микроскопа в качестве одной капли.Разрешить падение высохнуть на слайде в течение 30 минут при комнатной температуре. Вымойте белковое стекло слайды три раза, окунув их в стакан, содержащий PBS в течение двух секунд, чтобы удалить избыток неокрашенного белка. Теперь добавьте 10 миллилитров свежей культуры Hif в стерильную пластиковую чашку Петри и погрузите стеклянные горки с покрытием в культурную среду.Инкубировать посуду при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа при тряске при 20 об/мин. После инкубации удалите любые несвехие бактерии, погрузив слайды три раза в стакан, наполненный PBS, прежде чем визуализировать связанные бактерии грам окрашиванием, как описано в текстовом протоколе. Культура A549 эпителиальных клеток, как описано в текстовом протоколе.После одной стирки и трипсинизации клеток при 37 градусах Цельсия разбавляйте подвес клеток до 5 000 клеток на миллилитр, используя полную среду, содержащую пять микрограммов на миллилитр гентамицина. До бактериальной инфекции, заменить средний в скважинах со средним F12 и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию. Вымойте монослой клетки три раза с одним миллилитром PBS при комнатной температуре.Затем поместите пластину на лед и 200 микролитров предварительно охлажденной среды F12, содержащей 10 микрограмм на миллилитр витронектина. После инкубации пластины при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа, отбросить раствор путем трубопроводов и мыть слой клетки дважды с одним миллилитром PBS при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров свежеросого дикого типа Hif в F12 medium к каждому хорошо.Инкубировать пластину в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию. Затем, аспирировать среды с пипеткой и мыть A549 эпителиальных клеток три раза с PBS. Добавьте 50 микролитров на колодец раствора клеточного отслоения и следуйте пятиминутной инкубации при 37 градусах по Цельсию.Затем добавьте 50 микролитров полной среды F12 на колодец, чтобы остановить энзиматические реакции. Перенесите эпителиальные клетки из каждого хорошо в шесть миллилитров стеклянной трубки, содержащей четыре стеклянных бусинки. Высасыв клетки при комнатной температуре вихрем в течение двух минут.После разбавления клетки лизать 100 раз, пластины 10 микролитров разбавленного образца на шоколадную агарную тарелку. Подсчитайте колонии после ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию. Для проведения анализа Витронектин-зависимой устойчивости к бактерицидной активности человеческой сыворотки, первой культуры и гранул бактерий, как описано в текстовом протоколе.После центрифугации, повторно бактериальной гранулы с одним томом Декстроза-Gelatin-Веронал буфера. Теперь добавьте 1500 CFU бактерий к 100 микролитров DGVB плюс плюс содержащие 5%сыворотки. Инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут при тряске при 300 об/мин.Удалите 10 микролитер aliquot из реакционной смеси на ноль минут и 15 минут. Поместите aliquot на шоколадный агар и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию на ночь. После инкубации шоколадных агарных пластин подсчитайте колонии, появляющиеся на тарелках, и рассчитайте процент убитых бактерий, как описано в текстовом протоколе.Все клинические изоляты Hif, протестированные в этом исследовании, набрали виронектин на поверхность клетки, определяемую цитометрией потока. Связывание виронектина диким штаммом Hif вызвало сдвиг в популяции, в то время как мутант не связывает Виронектин. Белково-белковые взаимодействия между основным витронектин-связывающим белком PH и витронектином были оценены ELISA.Результаты указывают на значительное взаимодействие между PH и как vitronectin и положительный контроль по отношению к отрицательному контролю. Взаимодействие между PH и Vitronectin оценивалось в режиме реального времени с использованием биослойной интерферометрии, чтобы иметь сродство 2,2 микромолара. Кроме того, бактериальное отсутствие экспрессии PH на поверхности клетки продемонстрировали снижение приверженности витронектин покрытием стеклянных поверхностей по сравнению с дикими клетками типа.Кроме того, наличие виронектина на поверхности эпителиальных клеток значительно повысило приверженность Hif. Для оценки комплекторной ингибирования активности витронектина было исследовано убийство при посредничестве сыворотки. Дикие клетки Hif проявляли более высокую устойчивость к сыворотке, чем клетки-мутанты.При наличии тепловой инактивированной сыворотки бактерий не погибло. Интересно, что дикий тип Hif выставлены снижение выживаемости в Виронектин истощенной сыворотки и пополнения Виронектин увеличение выживаемости бактерий. Тем не менее, штамм мутантов не реагировал на истощение витронектина, потому что он не мог завербовать Витронектин на поверхность клетки.После освоения, этот метод может быть сделано в течение трех-четырех дней для любого патогена и не забудьте использовать свежую культуру бактериальных патогенов. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как проанализировать Витронектин связывания с патогеном. В дополнение к этому методу, Vitronectin связывания поверхностных белков бактерий могут быть определены с помощью протеомии и западной blotting.Этот метод важен для исследователей в области взаимодействия хозяина и патогена, а также для изучения механизма вирулентности у бактерий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Пробирной бактериальной адгезии на эпителиальных клетках млекопитающих

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Усиление и Количественная РНК ВИЧ-1 у ВИЧ-инфицированных с вирусной нагрузки ниже предела обнаружения стандартными клиническими Анализы

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Однодневный рабочий процесс Схема бактериальных патогенов обнаружения и антимикробной сопротивления из крови культур

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

В пробирке и в естественных моделью для изучения бактериальной адгезии к стенке сосуда в проточных условиях

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...