Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Anna y Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. y Edla Johansson Foundation, el Consejo de investigación médica sueco (concesión número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fundación de cáncer en la Universidad Hospital de Malmö, la sociedad fisiográfica (Fundación de Forssman) y del Consejo de Condado de Skåne investigación y Fundación para el desarrollo.

1. Análisis de Vn como un ligando de la proteína bacteriana de la superficie
<ol><li>
Detección de Vn-atascamiento en la superficie bacteriana mediante citometría de flujo Nota: En citometría de flujo, utilizamos lado dispersión y dispersión hacia delante para puerta de sucesos positivos. Para examinar las interacciones con Vn, Hif clínico aislados (n = 10) fueron seleccionados7 junto con e. coli BL21 (DE3) como control negativo (figura 1...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

Patógenos bacterianos reclutan Vn a la superficie de la célula y utilizan este regulador complemento para evitar la deposición de los factores de complemento y completar el complejo de ataque de membrana2. VN también funciona como una molécula puente entre proteínas de la superficie bacterianas y receptores de superficie celular host, permitiendo así que los patógenos se adhieren a la superficie de las células epiteliales y posteriormente median internacionalización. En este estudio, se ...

Vitronectina (Vn) es una importante glucoproteína humana implicados en el mantenimiento de la homeostasis a través de la regulación del sistema fibrinolítico. VN también funciona como un regulador del complemento mediante la inhibición de la vía del complemento terminal durante la formación de complejos de C5b6-7 y la polimerización de C9. Varios patógenos bacterianos se han demostrado para reclutar Vn a la superficie celular como medio de resistencia complemento deposición1,2,3. Además, Vn funciona como una molécula "sandwich" entre bacterias y receptores de las células epiteliales host, tal modo de promover la adhesión y la internalización de patógenos2,4,5. Unión de Vn a la superficie de la célula bacteriana está mediada por otras proteínas actualmente no identificados. Elucidar completamente el papel funcional de Vn-enlace de evasión de la respuesta inmune de la manguera por lo tanto requerirá identificación de proteínas Vn-reclutamiento.
El paso inicial en la identificación de proteínas de unión a Vn es probar si un patógeno de interés puede enlazar purificada Vn. flujo cytometry es un método conveniente y sencillo para determinar si Vn está limitado a las células del patógeno. En este estudio, se evaluó el atascamiento de Vn a varios Haemophilus influenzae tipo f (Hif) aislamientos clínicos6. El método descrito en este documento es cuantitativo y puede utilizarse para distinguir la capacidad de unión de una gran variedad de cepas bacterianas. En un estudio anterior hemos caracterizado proteína H (PH) de Hif como Vn vinculante proteínas7. Por lo tanto, en el presente estudio, el potencial de unión a Vn de los mutantes de tipo salvaje (WT) Hif y Hif M10Δlph se compararon utilizando los protocolos descritos.
Una vez que determine que un patógeno une Vn, el segundo paso es caracterizar el proteoma superficial con el fin de identificar potenciales proteínas Vn. Una variedad de enfoques se puede utilizar para este propósito8,9, pero estas metodologías no se describen en este informe. El método más adecuado para examinar las interacciones proteína-proteína es expresar las proteínas de la superficie bacterianas de e. coli por vía recombinante y purificar por cromatografía de afinidad. Aquí, utilizamos el PH y su interacción molecular con Vn para ilustrar el método. Interacciones entre recombinante PH y Vn se caracterizaron usando una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo7 y una técnica recientemente desarrollada etiqueta-libre conocido como bio-capa interferometría (BLI)10,11. Mientras que Elisa puede utilizarse para confirmar las interacciones proteína-proteína, BLI proporciona datos detallados sobre los parámetros cinéticos de la interacción.
Para estudiar el papel funcional de Vn en la adhesión bacteriana, se pueden utilizar dos diferentes ensayos. El primer ensayo que se describe aquí es la medición directa de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn, mientras que el segundo ensayo examina adhesión a la superficie de las células epiteliales. Para el primer ensayo, portaobjetos fueron recubiertos con Vn y el atascamiento de WT o estirpes mutantes de Hif se evaluó por tinción de Gram y microscopía. Esta técnica distingue fácilmente las bacterias basadas en la capacidad de atar Vn12. Luego se analizó la adherencia bacteriana a las células de mamífero mediante la adición de bacterias cultivadas sobre una monocapa de células epiteliales alveolares de tipo II; fijación bacteriana se evaluó contando el número de la Colonia formando unidades (UFC). Bacterias adheridas e interiorizadas se pueden diferenciar en la presencia o ausencia de Vn4,13.
El papel de la adquisición de Vn en la resistencia bacteriana del suero fue evaluado usando un análisis de muerte de suero (es decir, la actividad bactericida del suero). Para evaluar la importancia de la adquisición de Vn en resistencia de suero, la actividad bactericida del suero Vn-agotado (VDS) se comparó con la del suero humano normal (NHS). El método utilizado fácilmente distingue Vn vinculante frente a bacterias no vinculante basadas en resistencia de suero. Utilizamos este método para estudiar el papel de Vn en la resistencia de suero de varios patógenos bacterianos4,12.
Se han reportado numerosos métodos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Aquí, describimos un conjunto de protocolos que se pueden adaptar fácilmente al estudio de cualquier agente patógeno con el fin de evaluar el papel de Vn en patogenesia. Hemos probado estos protocolos utilizando diversos agentes patógenos, y Hif fue elegido como un ejemplo para este informe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

Las bacterias utilizan reguladores del complemento como un medio de evadir la respuesta inmune del huésped. Aquí, describimos protocolos para la evaluación de la adquisición de vitronectina de papel en los juegos de célula bacteriana superficial en la resistencia al sistema inmune anfitrión. Experimentos de citometría de flujo identifican vitronectina de plasma humano como un ligando de la proteína de membrana externa bacteriana del receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente era empleado para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre proteínas recombinantes purificadas H y vitronectina y atar afinidad se evaluó mediante interferometría de la bio-capa. La importancia biológica de la Unión de la vitronectina a H la proteína en la superficie de la célula bacteriana en evasión de la respuesta inmune del huésped fue confirmada usando una prueba de resistencia de suero con suero humano normal y vitronectina-agotado. La importancia de la vitronectina en la adhesión bacteriana se analizó utilizando portaobjetos de vidrio con y sin recubrimiento de vitronectina, seguido de la tinción de Gram. Por último, se investigó la adherencia bacteriana a las monocapas de células epiteliales alveolares humanas. Los protocolos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente al estudio de cualquier especies bacterianas de interés.

VN-Unión a la superficie de las bacterias fue determinada por citometría de flujo. Hif todos los aislados clínicos probados en este estudio reclutó a Vn a la superficie de la célula. Se observó ninguna interacción de Vn con la superficie de la célula para la cepa de control negativo e. coli (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, el PH es una importante proteína Vn en la s...

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Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Este informe describe los protocolos para la caracterización de las interacciones entre proteínas de membrana externa bacteriana y la vitronectina de regulador del complemento humano. Los protocolos pueden utilizarse para estudiar las reacciones de enlace y función biológica de vitronectina en cualquier especie bacteriana.

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como cómo los patógenos bacterianos causan enfermedades en los seres humanos mediante la utilización de proteínas humanas. La principal ventaja de esta técnica es que puede responder si cualquier patógeno puede utilizar Vitronectin para establecer la infección del huésped. Nos centraremos en Vitronectin, una proteína huésped que participa en la matriz extracelular, pero también funciona como un inhibidor del complemento en la vía determinante de activación del complemento.Estos hechos son muy importantes y muy atractivos para los patógenos que causan enfermedades en los seres humanos. Para prepararse para la citometría de flujo, resuspender los gránulos bacterianos con 50 microlitros de tampón de bloqueo que contiene 250 nanomolar Vitronectin. Luego, incubar las muestras durante una hora a temperatura ambiente sin agitar.Después de la incubación, peletizar la bacteria por centrifugación a 3,500 g durante cinco minutos. Luego, lave los pellets tres veces usando PBS y pasos similares de centrifugación. Después del lavado, añadir 50 microlitros de anticuerpos policlonales antihumanos primarios de oveja Vitronectin al pellet bacteriano en una dilución de uno a 100 en PBS BSA.Incubar la suspensión durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lave las bacterias tres veces con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos. A continuación, añada 50 microlitros de PBS BSA que contengan anticuerpos anticlonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína al pellet.Incubar a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Finalmente, después de tres pasos de lavado, resuspender el pellet bacteriano con 300 microlitros de PBS y analizar por citometría de flujo. Para prepararse para ELISA, dispensar 100 microlitros de solución proteica en cada pocóptico de una placa de microtíter PolySorp.Cierre la placa con la tapa y guárdela a cuatro grados Centígrados durante la noche para facilitar la inmovilización de proteínas en pozos de placas de microtíter. Deseche la solución de la placa de microtíter inclinando boca abajo sobre el fregadero. A continuación, lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBS por pozo.Bloquee los pozos recubiertos durante una hora a temperatura ambiente con PBS que contiene 2.5 por ciento de volumen de peso BSA. Después de retirar la solución de bloqueo, lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBST por pozo. Ahora, agregue 100 microlitros de 50 nanomolares recombinantes a su PH marcado a cada muestra.En los pozos de control, agregue sólo 100 microlitros de PBS BSA. Incubar el plato durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, deseche la solución proteica y elimine las proteínas no unidas lavando los pozos tres veces con 300 microlitros de PBST por pozo.A continuación, agregue 100 microlitros de PBS BSA que contengan anticuerpos anti-su policonales conjugados con rábano de caballo peroxidasa. Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBST por pozo. Detectar los complejos de anticuerpos antígenos mediante la adición de 100 microlitros de reactivo de detección ELISA a cada pozo.A continuación, agregue 50 microlitros de un ácido sulfúrico molar por pozo para detener la reacción. Mida la densidad óptica de los pozos a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas. Inmovilizar vitronectina humana en sensores reactivos de amina utilizando el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las directrices del fabricante.Usando PBS, diluya en serie el ligando PH recombinante de cero a cuatro micromolares y transfiera las soluciones resultantes a una placa de microtíter de fondo plano negro de 96 pozos. Ejecute el experimento a 30 grados centígrados utilizando un instrumento de interferometría de capa biológica. Pipetear 10 microlitros de una solución de dos microgramos por mililitro de Vitronectin en PBS en una diapositiva de microscopio de vidrio como una sola gota.Deje que la gota se seque en el portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos de vidrio recubiertos con proteínas tres veces sumergiéndolos en un vaso de precipitados que contenga PBS durante dos segundos para eliminar el exceso de proteína no recubierta. Ahora, agregue 10 mililitros de un cultivo Hif fresco en un plato de plástico estéril Petri y sumerja los toboganes de vidrio recubiertos en el medio de cultivo.Incubar los platos a 37 grados centígrados durante una hora con temblor a 20 RPM. Después de la incubación, elimine cualquier bacteria sin ataduras sumergiendo las diapositivas tres veces en un vaso de precipitados lleno de PBS antes de visualizar las bacterias enlazadas por tinción de Gram como se describe en el protocolo de texto. Cultivo A549 células epiteliales como se describe en el protocolo de texto.Después de un lavado y la tripsinización de las células a 37 grados Celsius, diluir la suspensión celular a 5.000 células por mililitro utilizando un medio completo que contenga cinco microgramos por mililitro de gentamicina. Antes de la infección bacteriana, reemplace el medio en los pozos con F12 medio e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Lave la monocapa celular tres veces con un mililitro de PBS a temperatura ambiente.A continuación, coloque la placa sobre hielo y 200 microlitros de medio F12 preenfriado que contengan 10 microgramos por mililitro de Vitronectin. Después de incubar la placa a cuatro grados centígrados durante una hora, deseche la solución pipeteando y lave la capa celular dos veces con un mililitro de PBS a temperatura ambiente. Añadir 100 microlitros de tipo salvaje Hif recién crecido en medio F12 a cada pozo.Incubar la placa durante dos horas a 37 grados centígrados. Luego, aspira el medio con una pipeta y lava las células epiteliales A549 tres veces con PBS. Agregue 50 microlitros por pozo de solución de desprendimiento celular y siga con una incubación de cinco minutos a 37 grados Centígrados.A continuación, añadir 50 microlitros de F12 medio completo por pozo para detener la reacción enzimática. Transfiera las células epiteliales de cada pozo a un tubo de vidrio de seis mililitros que contenga cuatro cuentas de vidrio. Lyse las células a temperatura ambiente por vórtice durante dos minutos.Después de diluir el lysate celular 100 veces, plato 10 microlitros de la muestra diluida en un plato de agar de chocolate. Contar las colonias después de una incubación durante la noche a 37 grados centígrados. Realizar el análisis de la resistencia dependiente de vitronectina a la actividad bactericida del suero humano, primer cultivo y pellet las bacterias como se describe en el protocolo de texto.Después de la centrifugación, resuspender el pellet bacteriano con un volumen de tampón de dextrosa-gelatina-Veronal. Ahora, agregue 1.500 UFC de bacterias a 100 microlitros de DGVB más más que contengan 5% de suero. Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos con agitación a 300 RPM.Retire una alícuota de 10 microlitios de la mezcla de reacción en cero minutos y 15 minutos. Coloque la alícuota sobre el agar chocolate e incubar el plato a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación de las placas de agar de chocolate, cuente las colonias que aparecen en las placas y calcule el porcentaje de bacterias muertas como se describe en el protocolo de texto.Todos los aislados clínicos de Hif probados en este estudio reclutaron Vitronectin a la superficie celular según lo determinado por la citometría de flujo. La unión de Vitronectin por la cepa De Hif de tipo salvaje causó un cambio en la población, mientras que el mutante no unía a Vitronectin. ELISA estimó las interacciones proteína-proteína entre la proteína principal de unión a Vitronectina PH y Vitronectin.Los resultados indican una interacción significativa entre PH y Vitronectin y el control positivo en relación con el control negativo. La interacción entre PH y Vitronectin se estimó en tiempo real utilizando interferometría de capa biológica para tener una afinidad de 2,2 micromolares. Además, la falta bacteriana de la expresión de PH en la superficie celular presentaba una menor adherencia a las superficies de vidrio recubiertas de Vitronectina en comparación con las células de tipo silvestre.Además, la presencia de Vitronectin en la superficie de las células epiteliales mejoró significativamente la adherencia de Hif. Para estimar el complemento que inhibe la actividad de Vitronectin, se examinó la matanza mediada en suero. Las células Hif de tipo salvaje presentaban una mayor resistencia sérica que las células mutantes.No se mataron bacterias en presencia de suero inactivado por calor. Curiosamente, el tipo salvaje Hif exhibió una menor supervivencia en el suero agotado por Vitronectina y la reposición de Vitronectin aumentó la supervivencia bacteriana. Sin embargo, la cepa mutante no respondió al agotamiento de Vitronectin porque no pudo reclutar Vitronectin a la superficie celular.Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres o cuatro días para cualquier patógeno y recordar utilizar el cultivo fresco de los patógenos bacterianos. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión sobre cómo analizar la unión vitronectina a un patógeno. Además de esta técnica, las proteínas superficiales de unión a Vitronectina de las bacterias se pueden identificar mediante el uso de proteómica e hinchazón occidental.Esta técnica es importante para los investigadores en el campo de la interacción huésped-patógeno y también para explorar el mecanismo de virulencia en las bacterias.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Investigación

Inmunología e Infección

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...