Name: assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från den Foundation i Anna och Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. och Edla Johansson stiftelse, den medicinska forskningsrådet (bevilja nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Stiftelsen Cancer vid universitetet Sjukhuset i Malmö, Fysiografiska samhället (Forssman's Foundation), och Skåne landstingets forskning och Development Foundation.

1. analys av Vn som en bakteriella Surface Protein Ligand
<ol><li>
Påvisande av Vn-bindande vid bakteriell ytan med hjälp av flödescytometri Obs: I flödescytometri, vi brukade side scatter och framåt scatter gate positiva händelser. För att undersöka interaktionen med Vn, Hif kliniska isolat (n = 10)7 valdes tillsammans med E. coli BL21 (DE3) som en negativ kontroll (figur 1A).<ol>
<li>Kultur Hif kliniska isolat ...

<ol>
	<li>Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+in+bacterial+pathogenesis:+a+host+protein+used+in+complement+escape+and+cellular+invasion.">Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion.</a> Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).</li><li>Hallstrom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Patterns+of+Microbial+Immune+Escape:+Pathogenic+Microbes+of+Diverse+Origin+Target+the+Human+Terminal+Complement+Inhibitor+Vitronectin+via+a+Single+Common+Motif.">Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif.</a> PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).</li><li>Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sequence+diversity+in+the+Moraxella+catarrhalis.+UspA2/UspA2H+head+domain+on+vitronectin+binding+and+antigenic+variation.">Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation.</a> Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).</li><li>Singh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine-tuned+interaction+between+trimeric+autotransporter+haemophilus+surface+fibrils+and+vitronectin+leads+to+serum+resistance+and+adherence+to+respiratory+epithelial+cells.">A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).</li><li>Kohler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vitronectin+and+Factor+H+to+Hic+contributes+to+immune+evasion+of+Streptococcus+pneumoniae.+serotype+3.">Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3.</a> Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).</li><li>Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry,+sorting+and+immunocharacterization+with+proliferating+cell+nuclear+antigen+of+cycling+and+non-cycling+cells+in+synchronized+pea+root+tips.">Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips.</a> Planta. 202 (2), 188-195 (1997).</li><li>Al-Jubair, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+Type+f+Hijacks+Vitronectin+Using+Protein+H+To+Resist+Host+Innate+Immunity+and+Adhere+to+Pulmonary+Epithelial+Cells.">Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells.</a> J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Proteome-Wide+Discovery+of+Extracellular+Host-Pathogen+Interactions.">Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions.</a> J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).</li><li>Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-affinity+profiling+to+identify+host-pathogen+interactions.">Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Sultana, A., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+and+protein-nucleic+Acid+interactions+by+biolayer+interferometry.">Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry.</a> Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+acquires+vitronectin+via+the+ubiquitous+Protein+F+to+subvert+host+innate+immunity.">Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity.</a> Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).</li><li>Ronander, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+adhesin+protein+E:+characterization+and+biological+activity.">Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity.</a> J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Fleury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Haemophilus+influenzae+factor+H-Binding+lipoprotein+involved+in+serum+resistance.">Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance.</a> J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+and+image+analysis.">Microscopy and image analysis.</a> Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).</li><li>Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells.">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).</li><li>Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+A549+cell+line+as+a+type+II+pulmonary+epithelial+cell+model+for+drug+metabolism.">Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism.</a> Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).</li><li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance.">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li><li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors.">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li><li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins:+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii.">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li><li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins.">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li></ol>

Bakteriella patogener rekrytera Vn till cellytan och utnyttja detta komplement regulator för att hindra nedfall av komplementfaktorer och slutförandet av membran attack complex2. VN fungerar även som en bro molekyl mellan bakteriella ytproteiner och värd cellreceptorer yta, vilket gör att patogener att följa ytan av epitelceller och därefter medla internalisering. I denna studie beskriver vi protokoll som kan användas för att uppskatta i) bindningen av Vn till ytan av bakterieceller, ii) ...

Aktiebolaget Trav & Galopp (Vn) är en viktig mänsklig glykoprotein involverade i att upprätthålla homeostas via reglering av det fibrinolytiska systemet. VN fungerar även som en komplement-regulator genom att hämma den terminal komplementbanan under C5b6-7 komplexa bildande och C9 polymerisation. Flera bakteriella patogener har visat att rekrytera Vn till cellytan som ett sätt att motstå komplement nedfall1,2,3. Dessutom fungerar Vn som en ”smörgås” molekyl mellan bakterier och värd epitelial cellreceptorer, därmed främja följsamhet och internalisering av patogener2,4,5. Bindningen av Vn till bakteriella cellens yta medieras av andra för närvarande oidentifierade proteiner. Fullständigt belysa den funktionella rollen för Vn-bindning i skatteflykt av slang immunsvar kommer därför kräva identifiering av Vn-rekrytera proteiner.
Det första steget i att identifiera Vn-bindande proteiner är att testa om en patogen sevärdheter kan binda renat Vn. flödescytometri är en bekväm och okomplicerad metod för att bestämma huruvida Vn är bunden till patogen celler. I denna studie bedömde vi bindningen av Vn till olika Haemophilus influenzae typ f (Hif) kliniska isolat6. Den metod som beskrivs häri är kvantitativ och kan användas för att skilja den bindande kapaciteten av en mängd olika bakteriestammar. I en tidigare studie karakteriserade vi protein H (PH) i Hif som en Vn-bindande protein7. Därför, i den aktuella studien, Vn-bindande potential av vildtyp (WT) Hif och Hif M10Δlph mutanter jämfördes med protokollen beskrivs.
När det bestäms att en patogen binder Vn, är det andra steget att karakterisera det ytan proteomet för att identifiera potentiella Vn-bindande proteiner. En mängd metoder kan användas för detta ändamål8,9, men dessa metoder beskrivs inte i denna rapport. Metoden som är mest lämpade för att undersöka protein-protein interaktioner är att recombinantly uttrycka valda bakteriella ytproteiner i E. coli och rena genom affinitetskromatografi. Vi använder här, PH och dess molekylär interaktion med Vn för att illustrera metoden. Interaktioner mellan rekombinant PH och Vn präglades med en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 och en nyligen utvecklad etikett-fri teknik som kallas bio-lager interferometry (BLI)10,11. Elisa-test kan användas för att bekräfta protein-protein interaktioner, finns BLI detaljerade uppgifter angående de kinetiska parametrarna av interaktioner.
För att studera den funktionella rollen för Vn i bakteriell vidhäftning, kan två olika analyser utnyttjas. Den första analysen som beskrivs här är direkt mätning av bakteriell adherencen till Vn-belagda glasytor, medan den andra analysen undersöker adherencen till ytan av epitelceller. För första analysen, objektglas var belagda med Vn, och bindningen av WT eller muterade Hif stammar bedömdes genom Gramfärgning och mikroskopi. Denna teknik skiljer lätt bakterier utifrån förmågan att binda Vn12. Bakteriell vidhäftning till däggdjursceller analyserades sedan genom att lägga till odlade bakterier på en enskiktslager av typ II-alveolära epitelceller; bakteriella fastsättning bedömdes genom att räkna antalet kolonibildande enheter (CFUs). Följas och internaliserad bakterier kan urskiljas i närvaro eller frånvaro av Vn4,13.
Rollen av Vn förvärv i bakteriell serum resistens utvärderades med ett serum dödande analys (dvs, serum bakteriedödande aktivitet). För att bedöma betydelsen av Vn förvärv i serum motstånd, var den antibakteriella effekten av Vn-utarmat serum (VDS) jämfört med normala humant serum (NHS). Metoden används lätt skiljer Vn-bindande kontra icke-bindande bakterier baserat på serum motstånd. Vi använde denna metod för att studera rollen som Vn i serum motståndet av flera bakteriella patogener4,12.
Många metoder har rapporterats för att studera värd-patogen interaktioner. Här, beskriver vi en uppsättning protokoll som enkelt kan anpassas till studiet av eventuella patogener för att bedöma Vn roll i patogenesen. Vi testade dessa protokoll som använder olika patogener, och Hif valdes som ett exempel för detta betänkande.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1013px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1.5 mL thermomixter</td>
			<td style="width:288px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5355</td>
			<td style="width:272px;">dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>60819-138</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">5% CO2 supplied incubator&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BBD6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 mL polystyrene round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>89000-478</td>
			<td>12 &#215; 75 mm style with cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">24-well plates</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1009-100ML</td>
			<td>Laboratory analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">75 cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td>BD353136</td>
			<td>Vented</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well black flat bottom plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Tissue culture treated &#181;Clear black plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">A549 Cell Line human</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86012804-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Cell detachment enzyme (Accutase)&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-500ML</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">AR2G sensors</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td>18-5095</td>
			<td style="width:272px;">Sensor to immobilized protein by amino coupling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Acetone</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>97064-786</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Bovine Serum Albumins (BSA)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bibulous paper&#160;</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>28511-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Bio-layer interferometer</td>
			<td style="width:288px;">Pall Life Science</td>
			<td style="width:119px;">FB-50258</td>
			<td style="width:272px;">Bilayer interferometry measuring equipment</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Crystal violet solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP (C4b binding protein)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Carbol-fuchsin solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT8018-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Citric acid</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Decolorizing solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>75482-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">E. coli host (E. Coli BL21)</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Protein expression host</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">F12 medium</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421</td>
			<td style="width:272px;">Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:335px;">Flow cytometer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">651154</td>
			<td style="width:272px;">Cell analysis grade for research applications&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td style="width:272px;">Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Normal human serum (NHS)</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td>NHS</td>
			<td style="width:272px;">Pooled human serum</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies&#160;</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>STAR88F</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td style="width:272px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glucose</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Gelatin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Marienfeld</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">HRP-conjugated anti-His tag antibodies</td>
			<td style="width:288px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1269</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Human factor H</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A137</td>
			<td>Bought as Frozen liquid form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">C4BP</td>
			<td style="width:288px;">Complement Technology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A109</td>
			<td>Frozen solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1653-10G</td>
			<td>lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histidine affinity resin column (HisTrap HP)</td>
			<td style="width:288px;">GE Health Care Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5247-01</td>
			<td>Columns prepacked with Ni Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">His-tagged PH</td>
			<td style="width:288px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinantly expressed and purified in our lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Iodine solution</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT902-8FOZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Methanol</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-1LP</td>
			<td>Analysis grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">&#160;Microscope</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73</td>
			<td style="width:272px;">Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td style="width:272px;">plain, size 25 mm &#215; 75 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b))</td>
			<td style="width:288px;">Novagen</td>
			<td>69862-3</td>
			<td>DNA vector</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Polysorb microtitre plates&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9410</td>
			<td style="width:272px;">For ELISA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">6009</td>
			<td>American Chemical Society (ACS) grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Sheep anti-human Vn antibodies</td>
			<td style="width:288px;">AbD Serotec</td>
			<td>AHP396</td>
			<td style="width:272px;">Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Shaker&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Stuart Scientific</td>
			<td style="width:119px;">STR6</td>
			<td>Platform shaker</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:335px;">Tissue culture flask</td>
			<td style="width:288px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">3175167</td>
			<td style="width:272px;">75 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#160;Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3317</td>
			<td>Dry block heating and cooling shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>860336-100MG</td>
			<td>ELISA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Vitronectin (Vn) from human plasma</td>
			<td style="width:288px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>V8379-50UG</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for studying the role of vitronectin in bacterial adhesion and serum resistance

Bakterier utnyttjar komplement regulatorer som ett sätt att kringgå värd immunsvaret. Här beskriver vi protokoll för att utvärdera roll Aktiebolaget Trav & galopp förvärvet på bakteriell cell surface lekarna i motstånd mot värd immunsystemet. Flöde flödescytometri experiment som humanplasma Aktiebolaget Trav & galopp en ligand för bakteriell receptor yttre membranprotein H av Haemophilus influenzae typ f. En enzymkopplad immunosorbentanalys var anställd för att karakterisera de protein-protein interaktioner mellan renat rekombinant protein H och Aktiebolaget Trav & galopp och bindande affinitet bedömdes med hjälp av bio-lager interferometri. Den biologiska betydelsen av bindningen av Aktiebolaget Trav & galopp till protein H på bakteriella cellens yta i skatteflykt av värd immunsvar bekräftades med ett serum motstånd i råtthud med normal och Aktiebolaget Trav & galopp-utarmat humanserum. Vikten av Aktiebolaget Trav & galopp i bakteriell vidhäftning analyserades med glasskivor med och utan Aktiebolaget Trav & galopp beläggning, följt av Gramfärgning. Slutligen, bakteriell vidhäftning till mänskliga alveolära epitelceller enskiktslager undersöktes. De protokoll som beskrivs här kan lätt anpassas till studiet av alla bakteriearter sevärdheter.

VN-bindning till bakteriens yta bestämdes av flödescytometri. Alla Hif kliniska isolat testas i denna studie rekryterade Vn till cellytan. Ingen interaktion VN med cellytan observerades för E. coli negativ kontroll stammen (figur 1A). Som visas i figur 1B, är PH en större Vn-bindande protein på ytan av Hif celler. Bindning av Vn av WT Hif stammen orsakade M10 en förskjutning i bef...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance at JoVE.com

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Denna rapport beskriver protokoll för kännetecknar interaktioner mellan bakteriell yttre membranproteiner och den mänskliga komplement regulator Aktiebolaget Trav & galopp. Protokollen kan användas för att studera de bindande reaktioner och biologiska funktionen av Aktiebolaget Trav & galopp i någon bakteriearter.

Analyser för studerar roll för Aktiebolaget Trav &amp; galopp i bakteriell vidhäftning och Serum motstånd

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i host-patogen interaktion fält såsom hur bakteriella patogener orsaka sjukdom hos människor genom att utnyttja mänskliga proteiner. Den största fördelen med denna teknik är det kan svara om någon patogen kan utnyttja Vitronectin för upprättande av infektion av värden. Vi kommer att fokusera på Vitronectin, ett värdprotein som tar del i den extracellulära matrisen, men även fungerar som komplementhämmare i avgörande spridningsväg för komplementaktivering.Dessa fakta är mycket viktiga och mycket attraktiva för patogener som orsakar sjukdom hos människor. För att förbereda för flödescytometri, resuspend de bakteriella pellets med 50 mikroliter av blockerande buffert som innehåller 250 nanomolar Vitronectin. Därefter, inkubera proverna i en timme i rumstemperatur utan att skaka.Efter inkubation, pellet bakterierna genom centrifugation vid 3, 500 g i fem minuter. Sedan tvätta pellets tre gånger med hjälp av PBS och liknande centrifugeringen steg. Efter tvätt, tillsätt 50 mikroliter av primära får antihuman Vitronectin polyklonal antikroppar mot bakteriepellet vid en en till 100 utspädning i PBS BSA.Inkubera suspensionen i en timme i rumstemperatur. Sedan tvätta bakterierna tre gånger med PBS för att ta bort obundna antikroppar. Därefter lägger du till 50 mikroliter pbs BSA som innehåller fluorescein isothiocyanate konjugerad åsna anti-får polyklonal antikroppar till pelleten.Inkubera i rumstemperatur i en timme i mörker. Slutligen, efter tre tvättsteg, resuspend den bakteriella pelleten med 300 mikroliter av PBS och analysera genom flödescytometri. För att förbereda för ELISA, dispensera 100 mikroliter proteinlösning i varje brunn av en PolySorp mikrotiterplatta.Stäng plattan med locket och förvara i fyra grader Celsius över natten för att underlätta immobilisering av protein på mikrotiterplatta brunnar. Kassera lösningen från mikrotiterplattan genom att luta upp och ner över diskbänken. Sedan, tvätta brunnarna tre gånger med 300 mikroliter PBS per brunn.Blockera de belagda brunnarna i en timme i rumstemperatur med PBS innehållande 2,5 viktvolym procent BSA. Efter att du har tagit bort blockeringslösningen tvättar du brunnarna tre gånger med 300 mikroliter PBST per brunn. Nu, tillsätt 100 mikroliter av 50 nanomolar rekombinant hans-taggade PH till varje prov.I kontroll brunnarna, tillsätt endast 100 mikroliter av PBS BSA. Inkubera plattan i en timme i rumstemperatur. Efter inkubation, kassera proteinlösningen och avlägsna de obundna proteinerna genom att tvätta brunnarna tre gånger med 300 mikroliter PBST per brunn.Tillsätt sedan 100 mikroliter PBS BSA som innehåller pepparspadeperoxidaskonjugerat anti-hans polyklonala antikroppar. Efter inkubation i en timme i rumstemperatur, tvätta brunnarna tre gånger med 300 mikroliter PBST per brunn. Detektera antigen-antikroppskomplexen genom att tillsätta 100 mikroliter av ELISA-detektionsreagens till varje brunn.Tillsätt sedan 50 mikroliter av en molar svavelsyra per brunn för att stoppa reaktionen. Mät brunnarnas optiska densitet vid 450 nanometer med hjälp av en mikroplattläsare. Immobilisera humant Vitronectin på aminreaktiva sensorer med hjälp av aminkopplingsmetoden enligt tillverkarens riktlinjer.Med hjälp av PBS späds den rekombinanta PH-liganden ut från noll till fyra mikromolar och överför de resulterande lösningarna till en 96-väl svart flatbottens mikrotiterplatta. Kör experimentet vid 30 grader Celsius med hjälp av ett interferometriinstrument för bioskikt. Pipett 10 mikroliter av en två mikrogram per milliliter lösning av Vitronectin i PBS på ett glasmikroskop glida som en enda droppe.Låt droppen torka på glidglaset i 30 minuter i rumstemperatur. Tvätta de proteinbelagda glasglasen tre gånger genom att doppa dem i en bägare som innehåller PBS i två sekunder för att avlägsna överflödigt obestruket protein. Nu, tillsätt 10 milliliter av en färsk Hif kultur i en steril plast Petriskål och dränka belagda glas diabilder i odlingsmediet.Inkubera disken vid 37 grader Celsius i en timme med skakningar vid 20 RPM. Efter inkubation, avlägsna eventuella obundna bakterier genom att dränka objektglasen tre gånger i en bägare fylld med PBS innan de bundna bakterierna visualiseras genom Gramfärgning enligt beskrivningen i textprotokollet. Kultur A549 epitelceller enligt beskrivningen i textprotokollet.Efter en tvätt och trypsinization av cellerna vid 37 grader Celsius, späd cellen suspensionen till 5, 000 celler per milliliter med hjälp av komplett medium som innehåller fem mikrogram per milliliter gentamycin. Före bakteriell infektion, ersätta mediet i brunnarna med F12 medium och inkubera över natten vid 37 grader Celsius. Tvätta cellens monolager tre gånger med en milliliter PBS i rumstemperatur.Placera sedan plattan på is och 200 mikroliter av förkylda F12-medium som innehåller 10 mikrogram per milliliter Vitronectin. Efter inkubering av plattan vid fyra grader Celsius i en timme, kassera lösningen genom pipettering och tvätta cellskiktet två gånger med en milliliter PBS vid rumstemperatur. Lägg till 100 mikroliter av nyodlad Hif vild typ i F12 medium till varje brunn.Inkubera plattan i två timmar vid 37 grader Celsius. Därefter aspirera mediet med en pipett och tvätta A549 epitelceller tre gånger med PBS. Tillsätt 50 mikroliter per brunn av cellavlossningslösning och följ med en fem minuters inkubation vid 37 grader Celsius.Därefter lägger du till 50 mikroliter av F12 komplett medium per brunn för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Överför epitelcellerna från varje brunn till ett sex milliliterglasrör som innehåller fyra glaspärlor. Lysa cellerna i rumstemperatur genom att virvla i två minuter.Efter spädning av cellen lysate 100-faldig, tallrik 10 mikroliter av det utspädda provet på en choklad agar tallrik. Räkna kolonierna efter en övernattning inkubation vid 37 grader Celsius. Att utföra analysen av Vitronectin-beroende resistens mot bakteriedödande aktivitet av humant serum, första odling och pellet bakterierna som beskrivs i textprotokollet.Efter centrifugeringen, återanvänd bakteriepelleten med en volym Av Dextro-Gelatin-Veronal buffert. Nu, tillsätt 1, 500 CFU av bakterier till 100 mikroliter av DGVB plus plus som innehåller 5%serum. Inkubera provet vid 37 grader Celsius i 15 minuter med skakningar vid 300 RPM.Ta bort en 10 microliter alikvot från reaktionsblandningen vid noll minuter och 15 minuter. Placera alikvoten på chokladagarn och ruva plattan i 37 grader Celsius över natten. Efter inkubation av chokladagarplattorna, räkna kolonierna som uppträder på plattorna och beräkna andelen bakterier som avträckts enligt textprotokollet.Alla Hif kliniska isolat testas i denna studie rekryteras Vitronectin till cellytan som bestäms av flödescytometri. Bandet av Vitronectin vid den wild typen Hif anstränger orsakade en förskjutning i befolkningen eftersom mutanten inte binder Vitronectin. Protein-protein interaktioner mellan större Vitronectin-bindande protein PH och Vitronectin uppskattades av ELISA.Resultaten tyder på en signifikant interaktion mellan PH och både Vitronectin och den positiva kontrollen i förhållande till den negativa kontrollen. Interaktion mellan PH och Vitronectin uppskattades i realtid med hjälp av bio-layer interferometry att ha en affinitet på 2,2 mikromolar. Vidare uppvisade bakteriellt bristande uttryck för PH på cellytan minskad följsamhet till Vitronectin-belagda glasytor i jämförelse med vilda typceller.Dessutom, förekomsten av Vitronectin på ytan av epitelceller avsevärt förbättrat följsamheten av Hif. För att uppskatta komplement hämmande aktivitet vitronectin undersöktes serum-medierade dödande. Vilda typ Hif celler uppvisade högre serum resistens än mutanta celler.Inga bakterier dödades i närvaro av värme-inaktiverat serum. Intressant, vild typ Hif uppvisade minskad överlevnad i Vitronectin-utarmat serum och påfyllning av Vitronectin ökad bakteriell överlevnad. Den muterade stammen svarade dock inte på Vitronectin utarmning eftersom den inte kunde rekrytera Vitronectin till cellytan.När behärskar, denna teknik kan det göras i tre till fyra dagar för någon patogen och kom ihåg att använda den färska kulturen av de bakteriella patogener. Efter att ha sett den här videon bör du ha god förståelse för hur man analyserar Vitronectin bindningen till en patogen. Utöver denna teknik kan Vitronectinbindande ytproteiner av bakterier identifieras genom att använda proteomik och western blotting.Denna teknik är viktig för forskarna inom området för värd-patogen interaktion och även för att utforska mekanismen för virulens hos bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Program för bakteriell patogen Detection och provning av antimikrobiell resistens från blododlingar

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-medierad Forward Genetics Screening för Identifiering av gener involverade i Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk vidhäftning analys för studier av Grin Aktivering i T-lymfocyter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro och in vivo modell för att studera bakteriell vidhäftning till kärlväggen Under Flow Villkor

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

En flera Format polyakrylamid-baserad analys för att studera effekten av extracellulärmatrix stelhet på bakteriell infektion av vidhäftande celler

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...