Name: a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00
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著者は、イメージングの彼女の寛大な支援のため、ルースZelkha、MSに感謝します。この研究は、ARD、国立眼研究所、NIH、および研究から失明防止への無制限の助成金からコアグラントEY01792への助成金R01のEY024349-01A1、MEに臨床サイエンティスト育成プログラム賞K12EY021475によってサポートされていました。 ARDは失明を防止するための研究からキャリア開発賞を受賞です。

動物で行わすべての手順は、視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文での研究のための協会に準拠しています。 6ヶ月齢のオス/メスC57BL / 6J野生型マウスへフォーティーン四を使用した：10損傷モデルのためのマウスと対照動物として4（無傷角膜を）。 1.動物の準備<ol><li> 100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジン混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔?...

<ol>
	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence.">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li><li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells.">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+stem+cells:+characterization,+culture+and+transplantation.">Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation.</a> Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).</li><li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency:+A+review+of+different+strategies.">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns.">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride.">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li><li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium.">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li><li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development.">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li><li>Nakatsu, M. N., Gonz&#225;lez, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem/progenitor+cells.">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+goblet+cells+and+their+niche:+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency.">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li><li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

この記事では、LSCDのマウスモデルを作成するための再現性と比較的単純な技術が記載されています。注目に値するこのモデルのいくつかの重要な側面があります。まず、化学物質11を使用する機種、12とは異なり、損傷は主に表面上皮（と基底膜）を含み、下層の角膜実質にまたは他の眼内構造への最小限のダメージで。従って、手順を複雑にし、それがより困難輪?...

角膜上皮は角膜の透明性および完全性を維持するために必要とされます。それは、常に角膜や結膜の接合部に輪部の狭いゾーンに存在する上皮幹細胞によって生涯を通じて更新されます。これらの自己再生輪部幹細胞が両方正常および損傷後、角膜上皮の再生に重要な役割を果たしています。これらの幹細胞の部分的または完全な枯渇は、再発性角膜びらん、疼痛、角膜の瘢痕化および血管新生において杯細胞の出現をもたらし、未処理の、角膜失明を残した場合であろう。この条件は、輪部幹細胞欠損（LSCD）として知られており、特発性であり得ます。遺伝性;または起因する化学的または熱的傷害、長期的なコンタクトレンズは着用し、慢性炎症1-6に取得しました。 LSCDに関する研究は、適切な動物モデルを必要とするだけでなく、模倣、ヒトにおける疾患は、しかし、少なくともで、再現性と持続可能です他の角膜および眼の構造への損傷のマウント。このモデルは、治療を評価し、分子および細胞レベルでの疾患のメカニズムを解明することが必要です。 1前に説明したように、回転するバリを使用して、人は簡単上述の利点があり、少なくとも3ヶ月間持続するLSCDのマウスモデルを開発することができます。本研究の目的はLSCDの、簡単な再現性、持続可能なマウスモデルを提示することです。 回転バリが均等に根本的な間質1を傷つけることなく、上皮を除去する便利なツールです。創傷治癒研究において中心角膜びらん7,8を誘導するために使用されてきました。マウスでLSCDを作成するためにここに提示された技術は、以前に報告されていません。以前より回復Oで、不均一で傷害特に輪部と複数の変数の表現型1、9時鈍いスパチュラ結果と上皮を削る方法を導入F正常な角膜上皮1。鈍スクレーパと異なり、回転バリがよく7、8、10などの上皮基底膜を除去します。幹細胞を切断するための他の報告された方法は、下にある眼の構造への不要な損傷を引き起こすことができるだけでなく、有意な炎症およびその後の角膜の混濁またはにつながるだけでなく、水酸化ナトリウム、N-ヘプタノール、及び塩化ベンザルコニウムのような化学物質の使用を含みます上皮の扁平上皮化生11-15。回転バリは、これらの重篤な合併症に関連付けられていません。外科的に輪部上皮を除去し、単独で、または化学物質10、11、16を使用して、実行することがより困難であり、小さな目と（マウスなどの）薄い輪部上皮を有する動物における最良の選択肢ではありません。また、驚くべきことに、limbectomyはまだ10の背後にある輪部上皮の一部を残すことができます。 以下に記載された技術は、血管新生のANとLSCDになります患者における完全なLSCDの提示を模倣し、少なくとも3ヶ月1持続dはconjunctivalization。これは、マウスにおけるLSCDまたは創傷治癒の病態生理、免疫学、および潜在的な治療法を研究することを目指している人に適しています。おそらく、いくつかの修正を加えて、この手順は、ラットまたはウサギ10で行うことができます。回転バリが効率的に上皮を除去するように、角膜上皮摩耗/創傷および関連する治療または分子生物学的研究に関連する任意の研究に利用され得ます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

輪部幹細胞欠損（LSCD）は、角膜上皮が結膜に置換された後輪部上皮幹細胞の機能不全または損失の状態です。患者は、再発性角膜欠陥、痛み、炎症、および視力の喪失に苦しみます。 以前は、LSCDのマウスモデルを説明し、2他のモデルと比較しました。目標は、両方の模倣、ヒトにおける表現型とは、疾患の病態生理を研究し、新しい治療法を評価することを可能にするのに十分長く続くLSCDの一貫性のマウスモデルを生成することでした。ここでは、技術は、より詳細に説明します。 回転バリでの電動工具は、角膜表面から錆リングを除去するために、または患者における翼状片のベッドを滑らかにするために設計されています。所望LSCDモデルを作成するのに適した装置です。それはのように、小さな目での作業のために、それが適切になる細かいチップで容易に入手できる、使いやすいツールですマウスインチそのアプリケーションは、眼への不必要な外傷を防止し、多くの場合、化学的損傷モデルの場合と同様に、それは、不要な怪我にはなりません。鈍スクレーパとは対照的に、基底膜と上皮を除去します。このプロトコルでは、輪部領域は2回擦過した後、全体の角膜上皮は、角膜縁から角膜縁に剃毛しました。間質損傷を避けるために、注意が上皮は既に削除された後に角膜表面を磨くしないように注意しました。

この技術を実行した後ヶ月以内に、角膜の100％が（ 図1A。写真は、明視野下でのスリットランプとコバルトブルーフィルターに接続されたカメラで撮影された）表面的な血管新生を開発しました。目の18/20（90％）において、血管新生は、全角膜表面（ 図1A）が関与します。 2/20（10％）で、血管新生が3 4の角膜の象限で観察されたが、それは?...

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

The overall goal of this procedure is to create a reproducible, sustainable, and persistent mouse model of limbal stem cell deficiency. This simple technique provides a consistent animal model of limbal stem cell deficiency, without inducing unwanted injury to the eye, which is difficult to achieve with the standard chemical injury models. This model is useful for studying the disease process in long-term at cellular and molecular level.And for testing or comparing the efficacy of novel treatments. After anesthetizing the mouse, pinch the toe to ensure adequate depth of anesthesia. Inspect the eye under a slit lamp to verify the absence of any previous corneal injury.Instill a drop of 1%tetracaine hydrochloride onto the eye, and wait for 60 seconds. Next, gently apply 5%povidone iodine on the eye and the hair around it. After one minute, wipe off the drop or spread it onto the hair around the eye to prevent the hair from interfering with the tip of the tool.Prepare a sterile rotating burr and a pair of sterile bent tweezers, and keep them on a sterile sheet during the procedure. Now, stabilize the eye by grabbing the lids from the nasal side using the bent tweezers, and gently proctozing the eye. Be careful not to apply too much pressure.Under a surgical microscope, shave around the limbal area twice using the sterile rotating burr. Remove the whole corneal epithelium from limbus to limbus with the rotating burr in a circular fashion, and work with the lateral side of its tip. To avoid stroma injury, do not re-brush corneal parts from which the epithelium has been removed.Do not apply any pressure on the eye. Clean the brush tip as required. Apply a drop of sterile PBS on the cornea, and wipe away any detached epithelial sheets with a soft cleaning tissue.Then, shave the remaining epithelium, if any. Pay attention to the mouse tail to ensure adequate depth of anesthesia during the surgery. Apply a drop of Flourescein sodium onto the cornea.Clean the cornea after 30 seconds, and examine it under a microscope with a cobalt blue filter to verify the complete removal of the epithelium. After the procedure, place the animal in its cage on a heating blanket and observe it for 30-45 minutes until complete recovery from anesthesia. In the meantime, apply 1%Erythromycin Ophthalmic ointment to the eye and continue the application of the antibiotic daily for a week.In addition, inject a 0.1mg/kg of Buprenorphine subcutaneously immediately, and 12 hours after the procedure, and continue the injection twice a day for two days. This is the cornea phenotype one month after the procedure. You can see extensive neovascularization which is a feature of limbal stem cell deficiency.A normal cornea expresses Cytokeratin 12 but is devoid of Cytokeratin 8 or goblet cells. In limbal stem cell deficiency, Cytokeratin 8 and goblet cells appear on the cornea, while Cytokeratin 12 is lost. Once mastered, this technique will result in corneal neovascularization that will cover almost the entire mouse corneal surface in one month, and is stable up to three months.It is important to avoid re-brushing the corneal parts that the epithelium has already been removed. This can cause undesired stroma inflammation and opacification. Following development of limbal stem cell deficiency, experimental treatment methods can be tested and compared.Alternatively, treatments can be started shortly after the injury. This video displayed how to effectively remove the limbal and corneal epithelium to induce limbal stem cell deficiency in mouse. With some modifications, it can be performed on other animals as well.

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