Name: a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00
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Los autores agradecen a Ruth Zelkha, MS, por su generosa ayuda en la formación de imágenes. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo Clínico Científico Premio K12EY021475 a mí, conceder R01 EY024349-01A1 de ARD, el núcleo EY01792 subvención del Instituto Nacional del Ojo, NIH, y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera. ARD es el destinatario de un Premio desarrollo de la carrera de investigación para prevenir la ceguera.

Todos los procedimientos realizados en animales cumplen con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaraciones para el uso de animales en la investigación de la visión. Se utilizaron cuatro a catorce 6J de seis meses de edad, macho / hembra C57BL / tipo salvaje: diez ratones para el modelo de lesión y cuatro como animales de control (córneas no heridos). 1. Preparación de los animales <ol><li> Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de una 1...

<ol>
	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence.">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li><li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells.">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+stem+cells:+characterization,+culture+and+transplantation.">Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation.</a> Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).</li><li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency:+A+review+of+different+strategies.">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns.">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride.">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li><li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium.">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li><li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development.">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li><li>Nakatsu, M. N., Gonz&#225;lez, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem/progenitor+cells.">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+goblet+cells+and+their+niche:+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency.">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li><li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

En este artículo se describe una técnica reproducible y relativamente sencillo para crear un modelo de ratón de LSCD. Hay varios aspectos importantes de este modelo que vale la pena destacar. En primer lugar, a diferencia de los modelos que utilizan productos químicos 11, 12, la lesión implica principalmente el epitelio de la superficie (y la membrana basal), con un daño mínimo al estroma corneal subyacente o a otras estructuras intraoculares. Por lo tanto, no hay más que la inflamación y la cicatriz...

Se requiere que el epitelio de la córnea para mantener la claridad y la integridad de la córnea. Se renueva constantemente durante toda la vida de las células madre epiteliales que residen en el limbo-una zona estrecha en la unión de la córnea y la conjuntiva. Estas células madre limbares auto-renovación juegan un papel crucial en la regeneración del epitelio corneal, tanto normalmente y después de la lesión. agotamiento parcial o completa de estas células madre dará lugar a erosiones corneales recurrentes, dolor, cicatrización de la córnea y la neovascularización, la apariencia de las células caliciformes, y si se deja sin tratar la ceguera, la córnea. Esta condición se conoce como insuficiencia límbica (SIL) y puede ser idiopática; hereditario; o adquirida debido a las lesiones químicas o térmicas, lentes de contacto a largo plazo desgaste, y la inflamación crónica 1-6. La investigación sobre SIL requiere un modelo animal adecuado que no sólo imita la enfermedad en los seres humanos, pero es reproducible y sostenible, con el mínimo de unamonte de lesiones en otras estructuras de la córnea y oculares. Este modelo es necesaria para evaluar los tratamientos y para aclarar los mecanismos de la enfermedad a nivel molecular y celular. Como se ha descrito antes de 1, con el uso de una fresa giratoria, se puede desarrollar fácilmente un modelo de ratón de LSCD que cuenta con las ventajas antes mencionadas y persiste durante al menos tres meses. El objetivo de este estudio es presentar un modelo simple, reproducible y sostenible del ratón de SIL. La fresa de rotación es una práctica herramienta que elimina de manera uniforme el epitelio sin dañar el estroma subyacente 1. Se ha utilizado para inducir la erosión corneal central 7, 8 en los estudios de cicatrización de heridas. La técnica de la presente-presentado para crear LSCD en un ratón no se ha informado antes. Anteriormente introducido métodos de raspar el epitelio con un resultado espátula roma en una lesión menos uniforme, particularmente en el limbo y un fenotipo más variable 1, 9, con más o restauraciónf epitelio corneal normal de 1. A diferencia del raspador romo, la rebaba giratorio elimina la membrana basal epitelial, así 7, 8, 10. Otros métodos reportados por separar las células madre implican el uso de productos químicos, tales como hidróxido de sodio, n-heptanol, y cloruro de benzalconio, que no sólo puede inducir lesión no deseado a las estructuras del ojo subyacentes, sino que también puede conducir a la inflamación significativa y posterior opacificación corneal o epitelial metaplasia escamosa 11-15. La rebaba de rotación no está asociado con estas complicaciones graves. La extirpación quirúrgica del epitelio limbal, solo o con el uso de productos químicos 10, 11, 16, es más difícil de realizar y no es la mejor opción en los animales con ojos pequeños y una epitelio limbar delgada (como ratones). Además, sorprendentemente, limbectomy todavía puede dejar un poco del epitelio limbal detrás 10. La técnica descrita a continuación resultará en LSCD con una neovascularizaciónd conjuntivalización que imita la presentación del SIL completa en los pacientes y tiene una duración de al menos tres meses 1. Es adecuado para aquellos que tienen como objetivo estudiar la fisiopatología SIL o la cicatrización de heridas, la inmunología, y los tratamientos potenciales en ratones. Posiblemente, con algunas modificaciones, este procedimiento puede llevarse a cabo en ratas o conejos 10. Como la rebaba giratorio elimina eficazmente el epitelio, que se puede utilizar en cualquier investigación perteneciente a la abrasión corneal epitelial / herida y en cualquier tratamiento relacionado o estudios de biología molecular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

insuficiencia límbica (SIL) es un estado de mal funcionamiento o pérdida de las células madre epiteliales del limbo, después de lo cual el epitelio corneal se reemplaza con la conjuntiva. Los pacientes que sufren de defectos corneales recurrentes, dolor, inflamación y pérdida de la visión. Anteriormente, se ha descrito un modelo murino de SIL y se comparó con otros dos modelos. El objetivo era producir un modelo de ratón consistente de SIL que tanto imita el fenotipo en los seres humanos y dura el tiempo suficiente para que sea posible estudiar la fisiopatología de la enfermedad y evaluar nuevos tratamientos. Aquí, la técnica se describe en más detalle. Una herramienta motorizada con una fresa rotativa ha sido diseñado para eliminar los anillos de óxido de la superficie de la córnea o para alisar la cama pterigión en los pacientes. Es un dispositivo adecuado para crear el modelo SIL deseado. Se trata de una herramienta de fácil de usar fácilmente disponible con una punta fina que la hace apropiada para trabajar en pequeños ojos, comoen ratones. Su aplicación evita trauma innecesario a la vista y que no da lugar a lesiones no deseados, como a menudo es el caso de modelos de lesión química. A diferencia de un raspador romo, que elimina el epitelio con la membrana basal. En este protocolo, la zona del limbo fue pulida dos veces, y luego todo el epitelio corneal se afeitó de limbo a limbo. Para evitar lesiones estroma, se tuvo cuidado de no rozar la superficie de la córnea una vez que el epitelio ya se había eliminado.

Dentro de un mes después de realizar esta técnica, el 100% de las corneas desarrolló neovascularización superficial (Figura 1A. Las fotografías fueron tomadas con una cámara conectada a una lámpara de hendidura bajo un campo brillante y cobalto filtro azul). En 18/20 (90%) de los ojos, la neovascularización implicada toda la superficie corneal (Figura 1A). En 2/20 (10%), se observó neovascularización en tres de los cuatro cuadrantes de la córn...

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

The overall goal of this procedure is to create a reproducible, sustainable, and persistent mouse model of limbal stem cell deficiency. This simple technique provides a consistent animal model of limbal stem cell deficiency, without inducing unwanted injury to the eye, which is difficult to achieve with the standard chemical injury models. This model is useful for studying the disease process in long-term at cellular and molecular level.And for testing or comparing the efficacy of novel treatments. After anesthetizing the mouse, pinch the toe to ensure adequate depth of anesthesia. Inspect the eye under a slit lamp to verify the absence of any previous corneal injury.Instill a drop of 1%tetracaine hydrochloride onto the eye, and wait for 60 seconds. Next, gently apply 5%povidone iodine on the eye and the hair around it. After one minute, wipe off the drop or spread it onto the hair around the eye to prevent the hair from interfering with the tip of the tool.Prepare a sterile rotating burr and a pair of sterile bent tweezers, and keep them on a sterile sheet during the procedure. Now, stabilize the eye by grabbing the lids from the nasal side using the bent tweezers, and gently proctozing the eye. Be careful not to apply too much pressure.Under a surgical microscope, shave around the limbal area twice using the sterile rotating burr. Remove the whole corneal epithelium from limbus to limbus with the rotating burr in a circular fashion, and work with the lateral side of its tip. To avoid stroma injury, do not re-brush corneal parts from which the epithelium has been removed.Do not apply any pressure on the eye. Clean the brush tip as required. Apply a drop of sterile PBS on the cornea, and wipe away any detached epithelial sheets with a soft cleaning tissue.Then, shave the remaining epithelium, if any. Pay attention to the mouse tail to ensure adequate depth of anesthesia during the surgery. Apply a drop of Flourescein sodium onto the cornea.Clean the cornea after 30 seconds, and examine it under a microscope with a cobalt blue filter to verify the complete removal of the epithelium. After the procedure, place the animal in its cage on a heating blanket and observe it for 30-45 minutes until complete recovery from anesthesia. In the meantime, apply 1%Erythromycin Ophthalmic ointment to the eye and continue the application of the antibiotic daily for a week.In addition, inject a 0.1mg/kg of Buprenorphine subcutaneously immediately, and 12 hours after the procedure, and continue the injection twice a day for two days. This is the cornea phenotype one month after the procedure. You can see extensive neovascularization which is a feature of limbal stem cell deficiency.A normal cornea expresses Cytokeratin 12 but is devoid of Cytokeratin 8 or goblet cells. In limbal stem cell deficiency, Cytokeratin 8 and goblet cells appear on the cornea, while Cytokeratin 12 is lost. Once mastered, this technique will result in corneal neovascularization that will cover almost the entire mouse corneal surface in one month, and is stable up to three months.It is important to avoid re-brushing the corneal parts that the epithelium has already been removed. This can cause undesired stroma inflammation and opacification. Following development of limbal stem cell deficiency, experimental treatment methods can be tested and compared.Alternatively, treatments can be started shortly after the injury. This video displayed how to effectively remove the limbal and corneal epithelium to induce limbal stem cell deficiency in mouse. With some modifications, it can be performed on other animals as well.

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