Name: tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء فاسكيز المختبر لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للسرطان [CA097175، CA093279 إلى KMV]. والوقاية من السرطان ومعهد بحوث من تكساس [RP101501]. تمويل مقابل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان [CA093279 إلى KMV].

1. إعداد ICLS موجهة TFO على البلازميد ركائز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كميات متساوي المولية من pSupFG1 البلازميد 10،11 الحمض النووي (5 ميكروغرام DNA البلازميد هو نقطة انطلاق جيدة) مع السورالين مترافق TFO AG30 في 8 ميكرولتر من ثلاثي العازلة ملزمة [50...

<ol>
	<li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation.">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li><li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro.">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li><li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation.">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li><li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides.">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li><li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions.">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage,+DNA+repair,+and+mutagenesis.">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li><li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides.">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li><li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation.">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li><li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks.">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li><li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation.">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li><li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair.">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li><li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis.">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li><li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner.">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li><li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells.">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li><li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe.">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells.">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li><li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA:+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins.">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li><li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1.">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li><li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA.">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li><li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA.">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li><li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein/TATA+complex.">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li><li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V(D)J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA.">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li><li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage.">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li><li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks.">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li><li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo.">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes.">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li><li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA.">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li><li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells.">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li><li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells.">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li><li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells.">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li><li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+number+of+2'-O-(2-aminoethyl)+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides.">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li><li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy.">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li><li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer.">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li></ol>

تشكيل كفاءة ICLS موجهة TFO هو يعتمد على عاملين هامين: أولا، مكونات عازلة الصحيح (على سبيل المثال، MgCl 2) وتستغرق وقتا من حضانة TFO مع الركيزة الحمض النووي هدفه (تعتمد على تقارب ملزمة للTFO إلى هدفه على الوجهين، وتركيزات المستخدمة). والثانية، والجرعة المناسبة للأشعة...

ثلاثي تشكيل أليغنوكليوتيد] (TFOs) مأزق مزدوج الحمض النووي بطريقة تسلسل معين عن طريق الربط Hoogsteen الهيدروجين لتشكيل هياكل الثلاثي حلزونية 1-5. وقد استخدمت تقنية ثلاثي لاستجواب مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية البيولوجية، مثل النسخ، وإصلاح الحمض النووي من التلف، واستهداف الجين (إعادة النظر في المراجع 6-8). وقد استخدمت على نطاق واسع TFOs للحث على الضرر في مواقع محددة على البلازميدات مراسل 9،10. مختبرنا وغيرها قد استخدمت سابقا TFO، AG30، مربوط الى جزيء السورالين للحث على crosslinks DNA interstrand في مواقع محددة (ICLS) في الجين supF على pSupFG1 البلازميد 5،10-12. ICLS هي السامة للخلايا للغاية حيث أن هذه الآفات تشعبي تساهميا اثنين من خيوط الحمض النووي، وإذا تركت دون اصلاح، يمكن منع النسخ الجيني وتعيق آلية تكرار الحمض النووي 13،14. بسبب قدرتها السامة للخلايا، وقد استخدمت وكلاء ICL الذي يحفز كما أدوية العلاج الكيميائي في علاجمن السرطان وأمراض أخرى 15. ومع ذلك، وتجهيز وإصلاح ICLS في الخلايا البشرية ليست مفهومة جيدا. وبالتالي، فهم أفضل من الآليات التي تشارك في تجهيز ICLS في الخلايا البشرية يمكن أن تساعد على تحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي على أساس ICL. ICLS يسببها TFO وسيطة إصلاح لهم لديها القدرة على التسبب في تشوهات هيكلية مهمة لولب الحمض النووي. هذه التشوهات هي أهداف محتملة للبروتينات المعمارية، الذي ربط الحمض النووي مشوهة مع تقارب أعلى من لالكنسي B-شكل مزدوج الحمض النووي 16-20. هنا، درسنا جمعية بروتين المعماري وفيرة للغاية، HMGB1 مع ICLS في الخلايا البشرية عبر مناعي لونين (رقاقة) فحوصات على البلازميدات-السورالين crosslinked والتعرف على دور HMGB1 في تحوير طوبولوجيا من البلازميد-السورالين crosslinked في الإنسان لست] الخلايا السرطانية. HMGB1 هو وفيرة للغاية، وأعرب عن بتواجد مطلق غير لهلهجة البروتين المعماري الذي يربط الحمض النووي التالف وركائز الحمض النووي منظم بدلا من ذلك مع تقارب أعلى من الكنسي B-شكل الحمض النووي 17-20. وتشارك HMGB1 في العديد من عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي 16،21-23. لقد أثبتنا سابقا أن HMGB1 بربط ICLS موجهة TFO في المختبر مع قابلية عالية 20. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن عدم وجود HMGB1 زيادة تجهيز مطفرة من ICLS موجهة TFO وحددت HMGB1 بمثابة إصلاح النوكليوتيدات الختان (NER) المشارك عامل 23،24. مؤخرا، وجدنا أن HMGB1 يرتبط ICLS موجهة TFO في الخلايا البشرية والتوظيف لمثل هذه الآفات يعتمد على بروتين معدل الالتحاق الصافي، XPA 16. وقد تبين supercoiling السلبي من الحمض النووي للترويج لإزالة فعالة من آفات الحمض النووي التي كتبها NER 25، وقد وجدنا أن HMGB1 يدفع supercoiling سلبي تفضيلي على إخراج TFO اصق ICL التي تحتوي علىركائز منتصف (نسبة إلى ركائز غير التالفة البلازميدات) 16، توفير فهم أفضل للدور المحتمل (ق) من HMGB1 باعتبارها NER المشارك عامل. ليست مفهومة تجهيز ICLS تماما في الخلايا البشرية. وبالتالي، يمكن للتقنيات والمقايسات وضعت على أساس الأدوات الجزيئية الموصوفة هنا يؤدي إلى التعرف على البروتينات إضافية تشارك في إصلاح ICL، والتي بدورها قد تخدم أهدافا الدوائية التي يمكن استغلالها لتحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي للسرطان. هنا، نهج فعال لتقييم كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO في البلازميد من تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام تم مناقشتها. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام البلازميدات التي تحتوي على ICLS موجهة TFO، تقنيات لتحديد جمعية HMGB1 مع البلازميدات التالفة ICL في سياق الخلوي باستخدام المقايسات رقاقة تعديل تم وصفها. بالإضافة إلى ذلك، وهي طريقة سطحي لدراسة التعديلات التي أدخلها الطوبوغرافية عشروقد تم تحديد ه البروتين المعماري HMGB1، وتحديدا على ركائز البلازميد التالفة ICL في الخلية لست] الإنسان عن طريق إجراء فحوصات supercoiling عبر ثنائية الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. وصف تقنيات يمكن استخدامها لتعزيز فهم إشراك إصلاح الحمض النووي والبروتينات المعمارية في معالجة التلف في الحمض النووي المستهدفة على البلازميدات في الخلايا البشرية. وصفنا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتشكيل ICLS السورالين موجهة TFO-مواقع محددة على DNA البلازميد، ورقاقة البلازميد لاحق وsupercoiling فحوصات لتحديد البروتينات التي ترتبط بها مع الآفات، والبروتينات التي تغير طوبولوجيا الحمض النووي، على التوالي. يمكن تعديل هذه المقايسات لأداء مع غيرها من العوامل الحمض النووي المدمر، TFOs، ركائز البلازميد، وخطوط الخلايا الثديية من الفائدة. في الواقع، لقد أظهرنا أن هناك إمكانية فريدة وعالية تقارب موقع واحد على الأقل ملزم TFO داخل كل الجينات المشروح في الجينوم البشري (26). كيفمن أي وقت مضى، من أجل الوضوح، وصفنا هذه التقنيات لاستخدام TFO مترافق السورالين محددة (pAG30) على البلازميد الطفرة مراسل معين (pSupFG1) في خلايا U2OS الإنسان كما أننا قد تستخدم في موخرجي وفاسكيز، 2016 16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;HMT Psoralen-AG30</td>
			<td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>HPLC (or gel) purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td>
			<td>Cell signaling Inc.</td>
			<td>9003</td>
			<td>Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGB1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquine-diphosphate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628-50G</td>
			<td>For two-dimensional agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePORTER transfection reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T201015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>38042-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blak-Ray long wave ultraviolet lamp</td>
			<td>Upland, CA</td>
			<td>B 100 AP</td>
			<td>UVA lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>EQC-1100</td>
			<td>Water bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar filter</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80112939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO-RAD Chemidoc</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>XRS+ system</td>
			<td>DNA imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>Used for crosslinking&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70013073</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114-359</td>
			<td>DNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td>Low retention microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>InternationalLight Technologies</td>
			<td>ILT1400-A</td>
			<td>UVA dose measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human U2OS osteosarcoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-96</td>
			<td>Cultured according to supplier&#8217;s recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical adenocarcinoma HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC-CCL-2</td>
			<td>Cultured according to supplier&#8217;s recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal forward primer</td>
			<td>5&#8242;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal reverse primer</td>
			<td>5&#8242;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distal forward primer</td>
			<td>5&#8242;-aat acc gcg cca cat agc ag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distal reverse primer</td>
			<td>5&#8242;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks

مربع المجموعة عالية التنقل 1 (HMGB1) البروتين هو بروتين المعماري غير بسيطة التي تشارك في تنظيم العديد من الوظائف الهامة في الجينوم، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي. يربط HMGB1 على الحمض النووي مشوهة هيكليا مع ارتفاع تقارب من لالكنسي B-DNA. على سبيل المثال، وجدنا أن HMGB1 يربط الحمض النووي interstrand crosslinks (ICLS)، التي تربط تساهمي فروع اثنين من الحمض النووي، وتسبب تشويه الحلزون، وإذا تركت دون اصلاح يمكن أن يسبب موت الخلايا. نظرا لقدرتها السامة للخلايا، وتستخدم العديد من وكلاء ICL الذي يحفز حاليا وكلاء العلاج الكيميائي في العيادة. بينما تظهر وكلاء ICL تشكيل تفضيلات لبعض متواليات قاعدة (على سبيل المثال، 5&#39;-TA-3 &quot;هو موقع يشابك المفضل لالسورالين)، فإنها تحفز إلى حد كبير التلف في الحمض النووي بطريقة عشوائية. ومع ذلك، من خلال اقتران تساهميا وكيل ICL الذي يحفز إلى النوكليوتيد تشكيل ثلاثي (TFO)، الذي يربط الحمض النووي في تسلسل محددالطريقة الحمض النووي من التلف المستهدفة يمكن أن يتحقق. هنا، ونحن نستخدم TFO مترافق تساهميا على &#39;نهاية ل4&#39;-hydroxymethyl-4،5&#39; 5 (همت) السورالين trimethylpsoralen-8، لتوليد ICL في مواقع محددة على البلازميد الطفرة مراسل لاستخدام أداة لدراسة تعديل المعماري ومعالجة وإصلاح آفات الحمض النووي المعقدة التي HMGB1 في الخلايا البشرية. وصفنا تقنيات تجريبية لإعداد ICLS موجهة TFO على البلازميدات مراسل، واستجواب جمعية HMGB1 مع ICLS موجهة TFO في سياق الخلوي باستخدام فحوصات مناعي لونين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف فحوصات الحمض النووي supercoiling لتقييم تعديل المعماري معين من الحمض النووي التالف عن طريق قياس كمية من الأدوار superhelical أدخلت على البلازميد-السورالين crosslinked بواسطة HMGB1. هذه التقنيات يمكن استخدامها لدراسة دور البروتينات الأخرى المشاركة في تجهيز وإصلاح ICLS موجهة TFO أو غيرها من الأضرار الحمض النووي المستهدفة في أي خط من الخلايا في المصالح.

تشكيل ICL موجهة TFO-هو أمر حاسم لفحوصات البلازميد مقرها، والتي تستخدم لاستجواب الأدوار من البروتينات المعمارية في معالجة ICL في الخلايا البشرية. تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة السطحية لتحديد كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO. البلازميدات إيواء ICLS...

Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

أدوات لدراسة دور HMGB1 البروتين المعماري في تجهيز اللولب تشويه، والحمض النووي الخاصة بالموقع Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

The overall goal of the modified chromatin immunoprecipitation and DNA supercoiling experiments is to study the association and subsequent topological modifications induced by architectural proteins on site-specific DNA damage induced by chemotherapeutic or carcinogenic agents in human cells. This methodology will allow us to address key questions about DNA damage and repair which should facilitate discovery of new pharmacological targets for cancer therapy. Our technology allows us to direct site-specific DNA damage, and facilitates evaluation of critical DNA repair processes relevant to human cancer.To begin, 24 hours before transfection, plate 400, 000 mammalian cells per 60 millimeter dish in DMEM supplemented with 10%FBS without antibiotics. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide overnight. In a 14-milliliter round bottom tube, combine 30 microliters of room temperature transfectionary agent with 500 microliters of 1X growth medium that has been warmed to 37 degrees Celsius.In a second tube, combine two micrograms of TFO-directed ICL-containing plasmids in 500 microliters of 1X growth medium. Incubate the tubes at room temperature for 10 minutes. Combine mix one with mix two, and pipette up and down to thoroughly mix.Then incubate the solution at room temperature for 25 to 30 minutes. Next, use warm PBS to wash the cells twice. Then, add the transfection mix in a drop-wise fashion, distributing the solution evenly throughout the plate of cells.Add one milliliter of growth medium to the plate, and bring the final volume to two milliliters. Mix well, and place the culture plates at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Four hours later, replace the medium with three milliliters of growth medium with 10%FBS, and incubate an additional 16 hours.Following the incubation, add 80 microliters of fresh 37%formaldehyde per plate to the cells, and incubate at room temperature in the dark for 10 minutes. Quench the formaldehyde cross-linking by adding 300 microliters of chilled glycine per plate, and incubate for five minutes. Then remove the medium, and use chilled PBS to wash the plates twice.Next, after adding one millimeter of chilled PBS, collect the cells by scraping into a microcentrifuge tube on ice, keeping samples on ice at all times. Prepare cell pellets by centrifuging at 13, 400 times G, and four degrees Celsius for five minutes. Then, remove the supernatant, and place the pellets on ice.Use one milliliter of chilled Buffer A to homogeneously re-suspend the pellets, and incubate on ice for 10 minutes. Then, pellet the cells as before. Now, with one milliliter of chilled Buffer B, homogeneously re-suspend the pellets, and incubate on ice for 10 minutes with occasional mixing by inverting.Then pellet the cells as before. After re-suspending the cells again, in 200 microliters of chilled Buffer B, add two microliters of micrococcal nuclease, or MNase, and incubate the reaction at room temperature for 10 minutes. Then, stop the MNase reaction by placing the tubes on ice, and adding 40 millimolar EDTA.The level of digestion by micrococcal nuclease is very critical, because overdigestion may cause loss of signal, whereas underdigestion may cause a lot of nonspecific background. After pelleting the cells, re-suspend the pellets in 100 microliters of chromatin immunoprecipitation, or ChIP buffer, supplemented with protease inhibitor cocktail. Then, transfer the cell suspension to a thin-walled microcentrifuge tube.Sonicate the samples by floating them on a water bath sonicator for 20 seconds, followed by 20 seconds on ice. Repeat the sonication steps nine times to generate approximately 800 to 1, 200 base-pair fragments. To 20 microliters of the sonicated samples, add three microliters of five molar sodium chloride, and one microliter of RNase A.Vortex the tubes, and incubate them at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Then, add two microliters of proteinase K, and incubate at 65 degrees Celsius for two hours. After purifying the samples, according to the text protocol, run them on 1%agarose gel, and visualize with ethidium bromide. In three separate, pre-chilled siliconized tubes, add 30 microliters of lysate, and 70 microliters of chilled 1X ChIP buffer with added protease inhibitors.Add one microgram of anti-IgG, anti-histone H3, or anti-HMGB1 antibodies to the respective tubes. Incubate overnight in a cold room with continuous rotation. In the cold room, after re-suspending Protein G beads, add four microliters of the beads to each reaction tube, and incubate in a cold room with rotation for another two to four hours.Place the tubes on a magnetic rack to pellet the beads, and remove the supernatant. Add 200 microliters of 1X ChIP buffer with protease inhibitor cocktail to the pellets, and wash in the cold with rotation for five minutes. Next, with high salt 1X ChIP buffer, perform an additional wash.Then, use 160 microliters of elution buffer to re-suspend the pellets, and incubate at 37 degrees Celsius with rotation for 30 minutes. Pellet the beads, and collect the supernatant in a fresh tube. Add six microliters of five molar sodium chloride, and two microliters of proteinase K, and incubate overnight at 65 degrees Celsius.After purifying the DNA, according to the text protocol, perform PCR reactions using primer sets to the region or regions of interest, and resolve the products on a 1%agarose gel, stained with ethidium bromide. Prior to use, thaw previously prepared DNA repair synthesis buffer on ice, and add 40 millimolar phosphocreatine, and 2.5 micrograms of creatine phosphokinase. After preparing 10X supercoiling buffer, according to the text protocol, use one microliter of vaccinia topoisomerase 1 with 1X supercoiling buffer in a 10 microliter reaction to linearize 300 nanograms of supercoiled plasmid, PCA FG1.To the relaxed plasmids, add 25 microliters of freshly-thawed HeLa cell extract, and DNA synthesis buffer. Mix well, then add one microliter of vaccinia topoisomerase 1 to the reaction, and incubate at 37 degrees Celsius for one hour. Terminate the reactions by adding 1%SDS, and 0.25 milligrams per milliliter of proteinase K, and incubate at 65 degrees Celsius for two hours.After casting a 1%agarose gel with 1X TPE buffer, add DNA-loading dye to the reactions, and load the samples directly onto the gel at least four lanes apart. Run the gel for eight to 10 hours at two volts per centimeter in 1X TBE for the first dimension at room temperature to resolve the topoisomers. Prepare two liters of 1X TBE with three micrograms per milliliter of chloroquine phosphate.Soak the gel in 200 milliliters of the solution, covered in aluminum foil for 20 minutes. To electrophorese the gel in the second dimension, turn the gel 90 degrees in a clockwise fashion, and run it for four to six hours at two volts per centimeter in chloroquine containing 1X TBE to resolve the positive and negative supercoils. The amount of chloroquine in the electrophoresis buffer, and in the gel, is very critical, as well as running the gel at a very low voltage for the second dimension is very critical to separate the positive and the negative supercoils.After staining and destaining the gel, according to the text protocol, use an imager to visualize the thermodistribution of the topoisomers. As seen in this gel, approximately 79%of the plasmids harboring TFO-directed ICLs migrate with a slower mobility through the agarose gel matrix when compared to the uncross-linked control plasmids. ChIP assays performed on lysates from human U2OS cells transfected with either control plasmid or plasmids containing TFO-directed ICLs show enrichment of HMGB1 at the P-ICL region compared to the control region when immunoprecipitated with anti-HMGB1 antibody.When HMGB1 was depleted from the cells via siRNA treatment, the P-ICL-specific enrichment was diminished. When the same samples were immunoprecipitated using an anti-IgG antibody, minimal PCR amplification was detected. Finally, in this figure, two-dimensional agarose gel electrophoresis demonstrates architectural modification of the TFO-directed ICL-containing plasmids as negative supercoiling by HMGB1 in HeLa cell extracts.Once mastered, this technique can be performed in approximately five days, if performed correctly. While attempting this procedure, it's very important to remember that all the washes should be done in the cold room, as room temperature washes may increase the background signal. Following this procedure, other methods, such as siRNA-mediated protein depletion, followed by mutation screening assays, can be performed in order to answer questions, such as, is the protein of interest involved in DNA repair?Or, does it significantly alter the mutation spectra during the process? This technique paved the way to study association between proteins and site-specific DNA damage. After watching this video, you should have a good idea of how to study the association of architectural proteins to target a DNA cross-links, and subsequently, determine the effect of such association on the topology of the DNA.Don't forget that working with ethidium bromide can be extremely hazardous, and therefore, proper protective gear should be always worn during performing this experiment.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

اختبار دور البلازميدات Multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

مقايسة بسيطة وسريعة، والكمية لقياس إصلاح الحمض النووي-البروتين كروسلينكس على البلازميدات Transfected في خلايا الثدييات

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بدقه وكفاءه الناسخ ميكرورنا في النباتات

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

استخدام الأنسجة المجمدة في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...