Name: tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדה ואסקז לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים מכון הסרטן בריאות / לאומי [CA097175, CA093279 כדי KMV]; ואת מניעת סרטן מכון המחקר של טקסס [RP101501]. מימון תשלום גישה פתוחה: מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן [CA093279 כדי KMV].

1. הכנת ICLs מכוונת TFO על מצעים פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כמויות equimolar של pSupFG1 פלסמיד 10,11 DNA (DNA פלסמיד 5 מיקרוגרם הוא נקודת התחלה טובה) עם psoralen מצומדות TFO AG30 ב 8 μl של חיץ מחייב טריפלקס [גליצרול 50%, 10 מ&quot;מ טריס (pH 7.6), 10 מ&quot;מ MgCl 2] ו...

<ol>
	<li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation.">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li><li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro.">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li><li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation.">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li><li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides.">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li><li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions.">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage,+DNA+repair,+and+mutagenesis.">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li><li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides.">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li><li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation.">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li><li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks.">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li><li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation.">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li><li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair.">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li><li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis.">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li><li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner.">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li><li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells.">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li><li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe.">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li><li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells.">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li><li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA:+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins.">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li><li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1.">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li><li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA.">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li><li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA.">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li><li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein/TATA+complex.">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li><li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V(D)J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA.">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li><li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage.">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li><li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks.">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li><li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo.">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes.">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li><li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA.">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li><li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells.">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li><li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells.">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li><li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells.">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li><li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+number+of+2'-O-(2-aminoethyl)+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides.">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li><li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy.">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li><li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer.">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li></ol>

ההיווצרות היעילה של ICLs TFO המכוונת תלויה בשני גורמים מכריעים: ראשית, רכיבי חיץ נכון (למשל, MgCl 2) וזמן דגירה של TFO עם מצע DNA היעד שלה (תלוי הזיקה המחייבת של TFO למטרתה דופלקס, ועל ריכוזי בשימוש); ושנית, את המינון הנכון של UVA (365 ננומטר) הקרנה לגבש crosslinks psoralen ביעילות. הי...

טריפלקס יוצרי oligonucleotides (TFOs) לאגד דופלקס DNA בצורה רצף ספציפי באמצעות מליטה מימן Hoogsteen ליצירת מבנים משולשת הסליל 1-5. הטכנולוגיה טריפלקס נעשה שימוש כדי לחקור מגוון של מנגנונים biomolecular, כגון שעתוק, תיקון נזק DNA, גן מיקוד (הנסקרת ב אזכור 6-8). TFOs נעשה שימוש נרחב כדי לגרום נזק לאתר ספציפי על פלסמידים כתב 9,10. המעבדה שלנו ואחרים השתמשו בעבר TFO, AG30, קשור מולקולה psoralen לגרום crosslinks interstrand DNA ספציפיים לאתר (ICLs) בגן supF על פלסמיד pSupFG1 5,10-12. ICLs הם ציטוטוקסיים מאוד כשהפצעים קוולנטית crosslink שני גדילי דנ&quot;א, וכל עוד יוסיף מתוקן, יכול לחסום שעתוק גנים ומסכל מכונות שכפול הדנ&quot;א 13,14. בגלל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, סוכנים וישכנע כיל שימשו תרופות כימותרפיות לטיפולשל סרטן ומחלות אחרות 15. עם זאת, העיבוד ותיקון ICLs בתאים אנושיים אינו מובן היטב. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בעיבוד של ICLs בתאים אנושיים עשוי לעזור לשפר את היעילות של משטרי כימותרפיות מבוססי כיל. TFO-induced ICLs ביניים תיקון שלהם יש פוטנציאל לגרום לעיוותים מבניים משמעותיים סליל הדנ&quot;א. עיוותים כאלה הן מטרות סבירות עבור חלבונים אדריכליים, אשר נקשרים ל- DNA המעוותת עם זיקה חזקה יותר מאשר ה- DNA דופלקס B-צורה הקנונית 16-20. הנה, למדנו את שיוכה של חלבון אדריכלי בהיקף הנרחב ביותר, HMGB1 עם ICLs בתאים אנושיים באמצעות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מבחנים על פלסמידים-crosslinked psoralen וזיהיתי לחיקוי עבור HMGB1 בויסות את הטופולוגיה של DNA פלסמיד-crosslinked psoralen ב אנושי lysates תאים סרטניים. HMGB1 הוא שופע מאוד בכל מקום בגוף לידי ביטוי שאינו שלוהטון חלבון אדריכלי הנקשרת דנ&quot;א פגום מצעים DNA מובנים לחילופין עם זיקה חזקה יותר מאשר DNA B-הצורה הקנונית 17-20. HMGB1 מעורב בתהליכים מטבוליים כמה DNA, כגון שעתוק, שכפול הדנ&quot;א, תיקון דנ&quot;א 16,21-23. אנחנו הוכחנו בעבר כי HMGB1 נקשר TFO המכוונת ICLs במבחנה עם זיקה גבוהה 20. יתר על כן, אנו הוכחנו כי חוסר HMGB1 הגדיל את עיבוד מוטגנים של ICLs TFO-ביים HMGB1 מזוהה תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) שיתוף גורם 23,24. לאחרונה, מצאנו כי HMGB1 קשור TFO המכוונת ICLs בתאים אנושיים והגיוס שלה נגעים כאלה תלוי חלבון NER, XPA 16. Supercoiling השלילי של DNA הוכח לקדם את ההסרה היעילה של נגעי DNA על ידי נר 25, ומצאנו כי HMGB1 גורם supercoiling השלילי מועדף על יציקה המכילה כיל מכוון TFOמצעים באמצע (יחסית מצעים פלסמידים שאינם פגומים) 16, מתן הבנה טובה יותר של פוטנציאל התפקיד (ים) של HMGB1 בתור גורם שיתוף NER. העיבוד של ICLs לא מובן לחלוטין בתאים אנושיים; וכך, טכניקות המבחנים שהפותחים מבוססות על הכלים המולקולריים המתוארים כאן יכולים להביא לזיהויו של חלבונים נוספים המעורבים תיקון כיל, אשר בתורו עשוי לשמש מטרות תרופתיות כפי שאפשר לנצל כדי לשפר את היעילות של כימותרפיה לסרטן. הנה, גישה יעילה כדי להעריך את היעילות של היווצרות כיל TFO מכוונת ב- DNA פלסמיד על ידי denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose נדונה. יתר על כן, באמצעות פלסמידים המכילים את ICLs TFO-המכוון, טכניקות כדי לקבוע את הקשר של HMGB1 עם פלסמידים פגועים כיל בהקשר הסלולר באמצעות מבחני שבב שונים תואר. בנוסף, שיטה קלילה ללמוד שינויי טופולוגי הציגו ידי הדואר אדריכלי חלבון HMGB1, במיוחד על מצעים פלסמיד פגועי כיל lysates התא האנושי נקבע על ידי ביצוע מבחני supercoiling באמצעות דו מימדי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. הטכניקות המתוארות ניתן להשתמש כדי לקדם את ההבנה של המעורבות של תיקון דנ&quot;א וחלבונים אדריכליים בעיבוד של ניזק לדנ&quot;א ממוקד על פלסמידים בתאים אנושיים. אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להקמת ICLs psoralen אתר ספציפי TFO-מכוון על פלסמיד דנ&quot;א, וצ&#39;יפ פלסמיד עתידי supercoiling מבחני לזהות חלבונים מקשרים עם הנגעים, וחלבונים אשר משנים את הטופולוגיה DNA, בהתאמה. מבחנים אלה יכולים להיות שונים כדי לבצע עם סוכנים מזיקים אחרים לדנ&quot;א, TFOs, מצעים פלסמיד, שורות תאים יונקות עניין. למעשה, הראינו כי יש לפחות פוטנציאל אחד זיקה ייחודית גבוהה TFO מחייב אתר בתוך מכל גן מבואר בגנום האנושי 26. אֵיךפעם, לבהירות תיארנו טכניקות אלה לשימושם של psoralen מצומדות TFO ספציפיים (pAG30) על פלסמיד מוטציה-עיתונאי ספציפי (pSupFG1) בתאים אנושיים U2OS כפי שכבר מנוצל מוקהרג&#39;י &amp; ואסקז 2016 16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;HMT Psoralen-AG30</td>
			<td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>HPLC (or gel) purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td>
			<td>Cell signaling Inc.</td>
			<td>9003</td>
			<td>Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Green</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMGB1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Gel and PCR cleanup kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquine-diphosphate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628-50G</td>
			<td>For two-dimensional agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePORTER transfection reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T201015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>38042-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blak-Ray long wave ultraviolet lamp</td>
			<td>Upland, CA</td>
			<td>B 100 AP</td>
			<td>UVA lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>EQC-1100</td>
			<td>Water bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar filter</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80112939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO-RAD Chemidoc</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>XRS+ system</td>
			<td>DNA imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>Used for crosslinking&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70013073</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromocresol green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114-359</td>
			<td>DNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td>Low retention microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>InternationalLight Technologies</td>
			<td>ILT1400-A</td>
			<td>UVA dose measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human U2OS osteosarcoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-96</td>
			<td>Cultured according to supplier&#8217;s recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cervical adenocarcinoma HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC-CCL-2</td>
			<td>Cultured according to supplier&#8217;s recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal forward primer</td>
			<td>5&#8242;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proximal reverse primer</td>
			<td>5&#8242;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distal forward primer</td>
			<td>5&#8242;-aat acc gcg cca cat agc ag</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distal reverse primer</td>
			<td>5&#8242;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tools to study the role of architectural protein hmgb1 in the processing of helix distorting, site-specific dna interstrand crosslinks

קבוצת תיבת 1 ניידות גבוהה (HMGB1) חלבון הוא חלבון אדריכלי הלא היסטון כי הוא מעורב בויסות תפקידים חשובים רבים בגנום, כגון שעתוק, שכפול הדנ&quot;א, ותיקון דנ&quot;א. HMGB1 נקשר מעוות מבחינה מבנית DNA עם זיקה חזקה יותר מאשר ב-דנ&quot;א הקנונית. לדוגמה, מצאנו כי HMGB1 נקשר ל- DNA interstrand crosslinks (ICLs), אשר קוולנטית לקשר בין שני גדילי הדנ&quot;א, לגרום לעיוות של הסליל, וכל עוד יוסיפו מתוקנות יכול לגרום מוות של תאים. בשל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, כמה סוכנים וישכנע כיל משמשים כיום תרופות כימותרפיות במרפאה. בעוד יוצרי כיל סוכנים להראות העדפות עבור רצפים בסיס מסוים (למשל, 5&#39;-TA-3 &quot;הוא האתר crosslinking המועדף psoralen), הם בעיקר לגרום נזק לדנ&quot;א באופן בלתי מבוקר. עם זאת, על ידי קוולנטית צימוד הסוכן וישכנע כיל על oligonucleotide יוצרי טריפלקס (TFO), אשר נקשר ל- DNA בתוך ספציפי ברצףבאופן, נזק לדנ&quot;א ממוקד יכולה להיות מושגת. כאן, אנו משתמשים TFO מצומדות קוולנטית על &#39;קץ 4&#39;-hydroxymethyl-4,5&#39; 5, 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen ליצור כיל אתר ספציפי על פלסמיד מוטציה-הכתב להשתמש ככלי ללמוד את שינוי, עיבוד, ותיקון אדריכלי של נגעים DNA מורכב על ידי HMGB1 בתאים אנושיים. אנו מתארים טכניקות ניסוי להכין ICLs TFO-מכוון על פלסמידים כתב, וכדי לחקור את הקשר בין HMGB1 עם ICLs המכוונת TFO בהקשר הסלולר באמצעות מבחני immunoprecipitation הכרומטין. בנוסף, אנו מתארים מבחני supercoiling DNA להעריך שינוי אדריכלי מסוים של דנ&quot;א פגום על ידי מדידת כמות פניות superhelical הציג על פלסמיד psoralen-crosslinked ידי HMGB1. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אחרים המעורבים בעיבוד ותיקון ICLs TFO מכוונת או נזק לדנ&quot;א ממוקדים אחרים בכל שורת תאים של עניין.

כינונה של כיל מכוון TFO הוא קריטי עבור המבחנים מבוססים פלסמיד, אשר משמשים כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אדריכליים בעיבוד כיל בתאים אנושיים. Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose הוא דרך קלילה כדי לקבוע את היעילות של היווצרות כיל מכוונת TFO. פלסמידים מחסה ICLs TF...

Watch this Scientific Journal Video about Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks at JoVE.com

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

The overall goal of the modified chromatin immunoprecipitation and DNA supercoiling experiments is to study the association and subsequent topological modifications induced by architectural proteins on site-specific DNA damage induced by chemotherapeutic or carcinogenic agents in human cells. This methodology will allow us to address key questions about DNA damage and repair which should facilitate discovery of new pharmacological targets for cancer therapy. Our technology allows us to direct site-specific DNA damage, and facilitates evaluation of critical DNA repair processes relevant to human cancer.To begin, 24 hours before transfection, plate 400, 000 mammalian cells per 60 millimeter dish in DMEM supplemented with 10%FBS without antibiotics. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide overnight. In a 14-milliliter round bottom tube, combine 30 microliters of room temperature transfectionary agent with 500 microliters of 1X growth medium that has been warmed to 37 degrees Celsius.In a second tube, combine two micrograms of TFO-directed ICL-containing plasmids in 500 microliters of 1X growth medium. Incubate the tubes at room temperature for 10 minutes. Combine mix one with mix two, and pipette up and down to thoroughly mix.Then incubate the solution at room temperature for 25 to 30 minutes. Next, use warm PBS to wash the cells twice. Then, add the transfection mix in a drop-wise fashion, distributing the solution evenly throughout the plate of cells.Add one milliliter of growth medium to the plate, and bring the final volume to two milliliters. Mix well, and place the culture plates at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Four hours later, replace the medium with three milliliters of growth medium with 10%FBS, and incubate an additional 16 hours.Following the incubation, add 80 microliters of fresh 37%formaldehyde per plate to the cells, and incubate at room temperature in the dark for 10 minutes. Quench the formaldehyde cross-linking by adding 300 microliters of chilled glycine per plate, and incubate for five minutes. Then remove the medium, and use chilled PBS to wash the plates twice.Next, after adding one millimeter of chilled PBS, collect the cells by scraping into a microcentrifuge tube on ice, keeping samples on ice at all times. Prepare cell pellets by centrifuging at 13, 400 times G, and four degrees Celsius for five minutes. Then, remove the supernatant, and place the pellets on ice.Use one milliliter of chilled Buffer A to homogeneously re-suspend the pellets, and incubate on ice for 10 minutes. Then, pellet the cells as before. Now, with one milliliter of chilled Buffer B, homogeneously re-suspend the pellets, and incubate on ice for 10 minutes with occasional mixing by inverting.Then pellet the cells as before. After re-suspending the cells again, in 200 microliters of chilled Buffer B, add two microliters of micrococcal nuclease, or MNase, and incubate the reaction at room temperature for 10 minutes. Then, stop the MNase reaction by placing the tubes on ice, and adding 40 millimolar EDTA.The level of digestion by micrococcal nuclease is very critical, because overdigestion may cause loss of signal, whereas underdigestion may cause a lot of nonspecific background. After pelleting the cells, re-suspend the pellets in 100 microliters of chromatin immunoprecipitation, or ChIP buffer, supplemented with protease inhibitor cocktail. Then, transfer the cell suspension to a thin-walled microcentrifuge tube.Sonicate the samples by floating them on a water bath sonicator for 20 seconds, followed by 20 seconds on ice. Repeat the sonication steps nine times to generate approximately 800 to 1, 200 base-pair fragments. To 20 microliters of the sonicated samples, add three microliters of five molar sodium chloride, and one microliter of RNase A.Vortex the tubes, and incubate them at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Then, add two microliters of proteinase K, and incubate at 65 degrees Celsius for two hours. After purifying the samples, according to the text protocol, run them on 1%agarose gel, and visualize with ethidium bromide. In three separate, pre-chilled siliconized tubes, add 30 microliters of lysate, and 70 microliters of chilled 1X ChIP buffer with added protease inhibitors.Add one microgram of anti-IgG, anti-histone H3, or anti-HMGB1 antibodies to the respective tubes. Incubate overnight in a cold room with continuous rotation. In the cold room, after re-suspending Protein G beads, add four microliters of the beads to each reaction tube, and incubate in a cold room with rotation for another two to four hours.Place the tubes on a magnetic rack to pellet the beads, and remove the supernatant. Add 200 microliters of 1X ChIP buffer with protease inhibitor cocktail to the pellets, and wash in the cold with rotation for five minutes. Next, with high salt 1X ChIP buffer, perform an additional wash.Then, use 160 microliters of elution buffer to re-suspend the pellets, and incubate at 37 degrees Celsius with rotation for 30 minutes. Pellet the beads, and collect the supernatant in a fresh tube. Add six microliters of five molar sodium chloride, and two microliters of proteinase K, and incubate overnight at 65 degrees Celsius.After purifying the DNA, according to the text protocol, perform PCR reactions using primer sets to the region or regions of interest, and resolve the products on a 1%agarose gel, stained with ethidium bromide. Prior to use, thaw previously prepared DNA repair synthesis buffer on ice, and add 40 millimolar phosphocreatine, and 2.5 micrograms of creatine phosphokinase. After preparing 10X supercoiling buffer, according to the text protocol, use one microliter of vaccinia topoisomerase 1 with 1X supercoiling buffer in a 10 microliter reaction to linearize 300 nanograms of supercoiled plasmid, PCA FG1.To the relaxed plasmids, add 25 microliters of freshly-thawed HeLa cell extract, and DNA synthesis buffer. Mix well, then add one microliter of vaccinia topoisomerase 1 to the reaction, and incubate at 37 degrees Celsius for one hour. Terminate the reactions by adding 1%SDS, and 0.25 milligrams per milliliter of proteinase K, and incubate at 65 degrees Celsius for two hours.After casting a 1%agarose gel with 1X TPE buffer, add DNA-loading dye to the reactions, and load the samples directly onto the gel at least four lanes apart. Run the gel for eight to 10 hours at two volts per centimeter in 1X TBE for the first dimension at room temperature to resolve the topoisomers. Prepare two liters of 1X TBE with three micrograms per milliliter of chloroquine phosphate.Soak the gel in 200 milliliters of the solution, covered in aluminum foil for 20 minutes. To electrophorese the gel in the second dimension, turn the gel 90 degrees in a clockwise fashion, and run it for four to six hours at two volts per centimeter in chloroquine containing 1X TBE to resolve the positive and negative supercoils. The amount of chloroquine in the electrophoresis buffer, and in the gel, is very critical, as well as running the gel at a very low voltage for the second dimension is very critical to separate the positive and the negative supercoils.After staining and destaining the gel, according to the text protocol, use an imager to visualize the thermodistribution of the topoisomers. As seen in this gel, approximately 79%of the plasmids harboring TFO-directed ICLs migrate with a slower mobility through the agarose gel matrix when compared to the uncross-linked control plasmids. ChIP assays performed on lysates from human U2OS cells transfected with either control plasmid or plasmids containing TFO-directed ICLs show enrichment of HMGB1 at the P-ICL region compared to the control region when immunoprecipitated with anti-HMGB1 antibody.When HMGB1 was depleted from the cells via siRNA treatment, the P-ICL-specific enrichment was diminished. When the same samples were immunoprecipitated using an anti-IgG antibody, minimal PCR amplification was detected. Finally, in this figure, two-dimensional agarose gel electrophoresis demonstrates architectural modification of the TFO-directed ICL-containing plasmids as negative supercoiling by HMGB1 in HeLa cell extracts.Once mastered, this technique can be performed in approximately five days, if performed correctly. While attempting this procedure, it's very important to remember that all the washes should be done in the cold room, as room temperature washes may increase the background signal. Following this procedure, other methods, such as siRNA-mediated protein depletion, followed by mutation screening assays, can be performed in order to answer questions, such as, is the protein of interest involved in DNA repair?Or, does it significantly alter the mutation spectra during the process? This technique paved the way to study association between proteins and site-specific DNA damage. After watching this video, you should have a good idea of how to study the association of architectural proteins to target a DNA cross-links, and subsequently, determine the effect of such association on the topology of the DNA.Don't forget that working with ethidium bromide can be extremely hazardous, and therefore, proper protective gear should be always worn during performing this experiment.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

צינור ביואינפורמטיקה לנתח באופן מדויק ויעיל את המייקרואורפה בצמחים

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...