Name: using rna-sequencing to detect novel splice variants related to drug resistance in in vitro cancer models
Uploaded: 2016-12-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models at JoVE.com

The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).

세포 독성 시험 법을 통해 약물 저항 프로필 1. 특성 <ol><li> 백혈병 세포주 배양 <ol><li> 부모의 T 세포를 포함하는 10 ml의 RPMI-1640 배지에서 25cm 2 ALL 세포주 CCRF-CEM (CEM-WT)과 CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3를 포함한 약제 내성 서브 라인을 유지 2.3 μM 엽산 10 % 소 태아 혈청, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충. </li><li> 배양을 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ?...

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여기에서 우리는 약물 내성과 관련하여 차동 접합 이벤트를 식별하는 분석을 잘 확립 된 세포 독성 스크리닝 기술과 강력한 NGS 기반 transcriptomic을 결합하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 분광 분석은 시험 관내 암 모델에서 약물 민감도를 평가하기 편리하고 강력한 높은 처리량 방법이며, 세포 독성 검사를 수행하는 많은 실험실에 대한 첫 번째 선택을 나타냅니다. 이 방법에 대한 문제 ...

암 치료, 화학 요법에 대한 종양 세포의 내성 중 진성 또는 장기간 약물 노출시 획득 상당한 발전에도 불구하고, 백혈병 및 고형 종양 1 광범위한 치료 실패의 주요 원인이다. 시험관 세포주 모델 약물 내성의 기초가되는 메커니즘을 묘사하기 위해 화학 요법 제에 내성 암세포의 선택에 의해 단계적으로 개발된다. 이 절차는 임상에서 사용 된 체제를 모방하고, 따라서 적절한 저항 메커니즘 깊이 조사를 허용한다. 치료 후에도 내성 세포를 세포 생존력 / 세포 독성 분석 (2)를 사용하여 부모 감수성 세포와 구별된다. 일차 세포의 시험 관내 약물 내성 프로파일 화학 요법에 대한 임상 적 반응 (3)에 크게 관련이있는 것으로 밝혀졌다. 높은 처리량 cytotoxicity 분석법은 시험관 내에서 약물의 감도를 결정하는 편리한 방법을 구성한다. 여기서, 세포의 생존 능력에 의해 평가되어 예를 들면, 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 - 즉 특정 기판의 대사 전환 (에 기초 MTT 분석법 4, 따라서 세포의 미토콘드리아 활성을 반영 컬러 제품에 테트라 졸륨 염). 대안 적으로, 세포의 단백질 함량은에 sulforhodamine B (SRB) 검정을 이용하여 5 정량화 할 수있다. 여기서, 생존 세포의 수의 필요없이, 분광 광도계에 적합한 파장에서 측정 된 광학 밀도 (OD)에 비례 광범위하고 시간이 걸리는 셀 카운팅 절차. 소정의 화학 요법 약물에 의해 유도되는 성장 억제는 세포가 시험 제제로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 세포의 OD와 비교하고있는 웰의 OD에 기초하여 계산 될 수있다. 용량 - 반응 곡선이다 obta세포를 제어 할 상대 생존 세포의 비율에 비해 약물 농도를 플로팅 리트에 의해. 마지막으로, 약물 감수성은 미처리 세포 (IC 50)에 비하여 세포 성장의 50 % 저해를 초래 농도로서보고 될 수있다. 약제 내성의 기초가되는 메카니즘은 약물 활성 및 세포 대사의 결정 인자의 유전자 발현에 영향을 미치는 변경 등 여러 가지 이상을 포함한다. 돌연변이, 수차 전사에서와 전사 후 수준뿐만 아니라 방해 후생 유전 학적 조절을 포함하여이 분자 병변은 종종 약물 대사 또는 세포 사멸 6 중 관련된 유전자에 영향을 미칩니다. 대체 사전 mRNA의 접합과 복잡한 규제는 최근 암 세포 (7)의 약물 내성을 지시 할 수있는 새로운 개체로 주목을 받았다. 인간 유전자의 95 %까지 이러한 대안의 수단에 의해 정상 세포에 접합되고동일한 유전자에서 다양한 단백질 이소 형을 생성 단단히 조절 방법. 대체 접합은 종종 암에 규제가 완화되고, 여러 종양은 약물 대사 (즉, 데 옥시 시티 딘 키나제, folylpolyglutamate 합성, 또는 다제 내성 단백질) 6,8에 관여하는 유전자의 증가의 변형 접합을 특징으로한다. 그러나, 약제 내성 세포의 접합 프로파일의 포괄적 인 분석을 고통스럽게 부족하다. 따라서, 대안적인 스 플라이 싱 분석을위한 높은 처리량의 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될. 지난 10 년간 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 급속한 발전은 유전자 발현의 조절 및 다양한 생물학적 과정 (9)에서 자신의 역할을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력과 생물 의학 연구를 강화하고있다. RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 강력한 서브 프로그램이고transcriptomics의 분야에서 NGS의. 그것은의 miRNA, siRNA를, 및 기타 소형 RNA를 (정량적)을 동시에 수천 개의 유전자의 발현 패턴의 게놈 전체의 프로파일 링을 허용하고도 새로운 코딩의 mRNA의 특성에 적합 아니라 긴 비 코딩 RNA이다 클래스 (예를 들어, snRNA와 피르) 10, 11. RNA-SEQ 사체는 특성 (예를 들면, 생거 시퀀싱 및 발현 마이크로 어레이)에 대한 이전의 기술에 비해 많은 장점을 갖는다. 그것은 기존의 게놈 주석에 기초하지 않고, 그 해상도의 단일 뉴클레오티드 레벨을 가지며 그 발현 량 추정을위한 넓은 동적 범위를 갖는다. 간단히, RNA-SEQ 실험의 기본 실험 워크 플로우의 cDNA 라이브러리 건설 그리고 마지막으로, 대규모 병렬 깊은 시퀀싱 (12, 13)로 변환 한 다음 폴리아 데 닐화 성적 증명서 (mRNA를) 선택과 분열로 구성되어 있습니다. 때문에 sequencin의 급격한 하락지난 몇 년 동안, RNA-SEQ 위에 g 비용이 점차 다른 기술을 대체하고, 상당한 노력은 라이브러리 제조 프로토콜을 향상시키기 위해 이루어지고있다. 예를 들어, 옥시 우리 딘 트리 포스페이트 (dUTP를)하고, 이전의 PCR로 증폭, 우라실-DNA-glycosilase (UDG)로 표시 가닥을 소화와 두 번째 가닥 cDNA를 표시하여 mRNA의 성적 증명서의 가닥 정보를 유지하는 것이 가능하다. 이 프로세스는 발현 14,15 유전자 주석 및 추정의 정확도를 향상시킨다. 분석 및 RNA-서열 데이터의 해석은 생물 정보학 파이프 라인 16, 17 내에서 복잡하고 강력한 계산 소프트웨어 패키지 및 처리가 필요합니다. 우선, 원료는 엄격한 품질 기준에 도달하지 않는 서열을 기술 및 생물 인공물을 제거하고 폐기 (트리밍)에서 품질 관리를 거쳐 판독한다. 이어서,이 기준 게놈 맵핑 및 각 인덱싱 된 샘플 읽기유전자 수준, 엑손 수준, 또는 성적 증명서 수준에 순서대로 각 카테고리의 풍요 로움을 확인합니다. 애플리케이션에 따라, 정제 된 데이터는 대립 유전자 - 특이 적 발현, 대체 접합 유전자 융합체 및 단일 염기 다형성 (SNP가) (12)의 식별을위한 통계 모델을 통해 계산된다. 마지막으로, 선택된 레벨 (즉, 유전자 발현 또는 대체 스 플라이 싱) 차등 분석은 다양한 조건 하에서 얻어진 샘플과 비교하기 위해 사용될 수있다. 차동 접합 분석은 두 샘플 사이의 스플 라이스 사이트 사용의 차이를 설명합니다. 이 목적에 전념 소프트웨어 패키지의 증가는 다른 통계 모델, 성능 및 사용자 인터페이스 (18)에 따라 사용할 수 있습니다. 이 중, 매트 (성적 증명서 접합의 다변량 분석) 베이지안 통계 프레임 워크를 기반으로 자유롭게 사용할 수 있으며 정확한 계산 도구로 나온다과 diffe를 감지하도록 설계단일 또는 쌍으로 최종 RNA-서열 데이터 중 하나에서 rential 접합 이벤트. 정렬 (.bam) 파일에서 시작, 매트 대체 접합 이벤트의 모든 주요 유형을 검색 할 수 있습니다 (엑손 스키핑, 대안 3 &#39;스플 라이스 사이트, 다른 5&#39;스플 라이스 사이트, 상호 배타적 인 엑손과 인트론 보존 - 또한 그림 1 참조). 첫째, 소프트웨어 식별 인스턴스 엑손 스킵, 특정 스플 라이스 이벤트를 지원하는 판독하고, 두 종류로 분류한다. 조사 된 엑손 내에서지도 및 특정 엑손 두 업스트림 및 다운 스트림 측면 엑손 사이의 접합에 걸쳐 (정식 스플 라이스 이벤트) &quot;에 포함될 읽습니다&quot;. 두 측면 엑손 간의 접합부에 걸쳐 (대체 접합 이벤트) &quot;스킵 읽기&quot;. 그 후, 매트는 모두 정규 및 대체 이벤트에 대한 정규화 된 포함 수준을 반환하고 샘플 또는 조건 사이의 값을 비교합니다. 궁극적으로는 P-값 a를 계산ND 잘못된 탐색 비율 (FDR)은 두 상태 사이의 유전자 변형 비의 차이는 각각의 스 플라이 싱 19,34 이벤트에 대해 주어진 사용자 정의 임계 값을 초과한다고 가정. RNA-SEQ와 함께 차동 플라이 싱 분석에 따라, 광범위한 실험적인 검증이 참 양성 유전자 후보 (18)를 식별하기 위해 보장된다. 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)은 RNA 서열 분석-20에서 얻은 후보 확인에 가장 일반적으로 사용되는 최적의 방법이다. 본 연구의 목적은 고형 종양과 혈액 악성 종양의 약물 내성 관련 접합 프로파일을 조사 할 수있는 강력한 방법을 제공하는 것이다. 우리의 방법은 약제 내성에 관여 후보 유전자의 확인을 위해 설립 QRT-PCR 방법과 조합하여 약제 내성 암 선택된 세포주 모델 RNA-SEQ 기반 사체 프로파일을 이용한다. (21, 22)와 메토트렉세이트 (MTX) 모성 서브 라인 CEM / R30dm 23. GC를하고 MTX에 기초하여 현재 요법의 경우 약 90 %가 임상적인 이점을 수립했지만, GC 저항의 출현은 아직 불분명 분자 메커니즘 미해결 문제를 나타낸다. GC 강한 서브 클론을 분리, CEM-WT 세포는 2 ~ 3 주 동안 1 μM의 덱사메타손 (덱스)에서 배양 하였다. MTX 내성 서브 라인 CEM / R30dm 반복 단기 (24 시간) 임상 프로토콜의 모방으로 30 μM MTX에 CEM-WT 세포의 노출을 통해 개발되었다. 흥미롭게도,이 세포주는 또한기구가 완전히 이해되지 않은 덱스에 교차 내성 (미공개 결과)을 표시. 고체 다치또는 본 연구에서 조사 모델은 화학 요법과의 특별한 불응 악명 췌장 도관 선암이다. 이를 위해 Panc-1 세포주 및 약물 (24)의 1 μM 연속 배양에 의해 얻어진 그 타빈 내성 서브 클론 Panc-1R를 선택했다. 여기에서는 세 개의 프로토콜을 결합하여 체외 약물 내성 근본적인 새로운 메커니즘을 발견하는 방법을 설명합니다 비색 독성 분석법에 관련된 신규 스플 라이스 변이체를 식별 백혈병 세포 및 고형 종양, RNA-SEQ 기반 파이프 라인에서 암 세포에 약물 감수성을 평가 약물 감도 / 저항과 RT-PCR 및 QRT-PCR 분석은 잠재적 인 후보의 유효성을 검사합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="732">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sulforhodamine B</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">230162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">251399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">CCRF-CEM</td>
			<td style="width:195px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:119px;">ATCC CCL-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Panc-1</td>
			<td style="width:195px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:119px;">ATCC CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:195px;">Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Fetal bovine and calf serum</td>
			<td style="width:195px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">penicillin G streptomycin sulphate</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MTT formazan</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Anthos-Elisa-reader 2001</td>
			<td style="width:195px;">Labtec, Heerhugowaard, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>UV-Vis 96-well plate spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Greiner/Sigma</td>
			<td>M0812-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Trypsin/EDTA Solution 100 ml</td>
			<td style="width:195px;">Lonza, Basel, Switzerland</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:195px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>82051-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3</td>
			<td style="width:195px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)</td>
			<td>B.Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using rna-sequencing to detect novel splice variants related to drug resistance in in vitro cancer models

약물 내성은 혈액 학적 악성 종양 및 고형 종양 모두 암의 치료에서 주요 문제로 남아있다. 극한 후천적 내성이 증가 된 약제를 포함 제거 메커니즘들에 의해 야기 될 수 있고, 약물 흡수, 불 활성화 약물 및 약물 표적의 변경을 감소시켰다. 최근 데이터는 다른 이상이 잘 알려진 유전자 (돌연변이, 증폭) 및 후생 유전 학적 (DNA 메틸화, 히스톤 번역 후 변형) 개조로, 약제 내성 메커니즘도 스 플라이 싱 수차에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 계획하기 위해 미래의 관심을받을 자격이 조사 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사 대상으로합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열 및 설정을 통해 체외 모델에서 여러 가지의 transcriptomic 프로필을 분석에드 QRT-PCR 기반의 방법은 후보 유전자의 유효성을 검사합니다. 특히, 우리는 DDX5와 PKM 성적 증명서의 차동 스 플라이 싱을 평가 하였다. 계산 도구 매트에 의해 검출 된 비정상적인 스 플라이 싱은 다른 DDX5 스플 라이스 변종은 부모의 대 내성 세포에서 발현되는 것을 보여주는, 백혈병 세포에서 확인되었다. 이러한 세포에서는,도 타빈 노광에 의한 약제 내성의 다른 메커니즘을 제안 부모 Panc-1 세포에 비해 Panc-1 타빈 강한 상대 검출되지 않았다 높은 PKM2 / PKM1 비를 관찰 하였다.

프로토콜에 기술 된 세포 독성 분석법은 시험관 내에서 화학 요법 제에 암세포의 내성을 평가하기위한 안정적이고 강력한 방법을 제공한다. CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3 다음 MTT 분석에 의해, 덱스에 감도는 덱스에 민감한 부모의 CEM-WT 세포를 포함하여 4 개의 T-ALL 세포주, 3 덱스 강한 서브 라인에서 산출 된 것입니다. 및 덱스 내성 세포주 (640 μM - 0.33 ㎚) - 두 개의 다른 ?...

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Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

The overall goal of this protocol is to investigate the association of aberrant splicing with drug resistance profiles in in vitro models of solid tumors and hematological malignancies. This method can help answer key question in the field of molecular pharmacology and chemotherapy resistance such as which are the mechanism underlying drug resistance on post-transcriptional level? The main advantage of this technique is that it combines well established cytotoxicity screening protocol with powerful next generation sequencing based transcriptomic analysis.This technique could lead to a better understanding of the molecular mechanisms underlying chemotherapy failure and it will improve the early detection of drug resistance. This method can provide insight into genome-wide determinants of drug resistance in cell line models. But it can also be applied to other systems such as primary patient samples and xenograft.Demonstrating this procedure will be Johan Fomirno, a technician from our laboratory at the Cancer Center Amsterdam. To perform the MTT assay for leukemic cells, prepare 96-well flat bottom experimental plate. Dedicate wells to drug concentrations to control cells and to control medium without cells.Prepare a drug dilution range of dexamethasone or dex. Add 30 microliters from each dex dilution into an appropriate well of the 96-well plate. Make sure to include each concentration in triplicate.Harvest exponentially growing leukemic cells and re-suspend them at their optimal seeding concentration. Add 120 microliters of the cell suspension to each well containing either the drug solution or the growth medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 72 hours. After the incubation step, add 15 microliters of MTT reagent to each well by using a repetitive pipette.Shake the plate for five minutes with a plate shaker up to a maximum of 900 shakes per minute. Place the plates back at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide in a cell culture incubator and incubate for another four to six hours. Following incubation, make sure to thoroughly re-suspend the formazan crystals as the absorbance values depend on proper solubilization of the compound.Add 150 microliters of the acidified isopropanol to each well and mix well with a multichannel pipette to thoroughly re-suspend all the formazan crystals. Using a microplate reader, determine the optical density or OD at 540 and 720 nanometers to ensure an accurate measurement by correcting for background OD.To perform SRB assay for pancreatic carcinoma cells, prepare a 96-well flat bottom experimental plate. Seed pancreatic carcinoma cells growing in exponential phase in triplicate in a 96-well flat bottom plates at the appropriate density in 100 microliters of medium by using a multichannel pipette.Add 100 microliters of medium to medium-only wells and incubate overnight at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide to ensure proper adhesion of the cells to the plate. Add 100 microliters from each dilution into an appropriate well of the 96-well plate by using a multichannel pipette. Make sure to have each concentration in triplicate.Incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 72 hours. Next, add 25 microliters of cold TCA solution to the wells by using a multichannel pipette. Incubate the plates for at least 60 minutes at four degrees Celsius to precipitate and fix the proteins at the bottom of the wells.Empty the plate by removing the medium and dry briefly on a tissue. Wash five times with tap water before emptying the plate and drying at room temperature. Add 50 microliters of SRB solution per well by using a repetitive pipette and stain for 15 minutes at room temperature.Then, empty the plate by removing the SRB stain. After washing the plate four times with 1%acetic acid, empty the plate and let it dry at room temperature. Add 150 microliters of Tris solution per well by using a multichannel pipette and to mix for three minutes on a plate shaker up to a maximum of 900 shakes per minute.Read the optical density at 540 nanometers. Spin down the samples at 300 times g for three minutes. After removing the supernatant, extract total mRNA using commercially available silica membrane spin columns.Determine the concentration and purity of total RNA by using UV-Vis spectrophotometer. To prepare the sequencing library, use two micrograms of total mRNA per sample. Follow mRNA library preparation protocol according to manufacturer's instructions.After pooling the libraries in a single sample up to a final concentration of 10 nanomoles per liter using a bioanalyzer, use a high throughput sequencing system with single read 100 base pair mode. Design all primers as described in the text protocol. For first strand cDNA synthesis, set up reverse transcription of one microgram of the isolated RNA to cDNA by using 200 units per microliter of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase in its reaction buffer diluted one to five with sterile water.To perform the RT-PCR reaction, add one microliter of cDNA to the PCR reaction mix and place the tubes in the thermocycler. Run the program as described in the text protocol. Following PCR, load the samples into a 1%agarose gel and run the gel in TBE buffer at 100 volts for approximately 30 minutes in an electrophoresis system.To avoid cross contamination, use filter tips while performing the qRT-PCR assay. To perform qRT-PCR, prepare cyanine green PCR reaction mix for each specific splice variant to be detected as well as for the housekeeping gene. Load the master mix on a white 96-well plate and prepare duplicates for each sample.Add five microliters of cDNA diluted 10 times in water to each mix before placing the plate in the thermocycler. Growth inhibition curves as determined by MTT assay for leukemic cells and SRB assay for pancreatic carcinoma cells are depicted here. Curves for dexamethasone resistant and gemcitabine resistant cells are shifted to the right indicating growth inhibition as compared to the parental sensitive cells.The concentration and quality of cDNA libraries for all cell lines is determined with a bioanalyzer DNA chip. Electropherograms show fluorescence peaks at approximately 300 base pairs which are indicative of good quality for the subsequent RNA sequencing procedure. Short reads of the gene candidate DDX5 can be visualized as Sashimi plots where connecting lines represent splice junctions.DDX5 transcript shows differential usage of exon 12 and CEM wild-type and CEM/R30dm cells as compared to glucocorticoid-resistant cell lines, CEM-C3 and CEM-R5. RNA sequencing results are validated by performing RT-PCR on selected genes for which primer pairs and yield to exons located upstream and downstream of the alternatively spliced exon. Differential splicing of the DDX5 gene is shown here.Quantification of differentially-spliced transcripts through qRT-PCR assay using isoform-specific reverse primers confirms the specific down regulation of the DDX5 delta exon 12 splice variant and a specific glucocorticoid-resistant sub-lines. Once mastered, this technique can be done in three to four weeks. While attempting this procedure, it's important to remember to keep RNA samples on ice in order to avoid degradation.Following this procedure, other methods like ectopic overexpression of novel splice variant can be performed. This will answer additional questions like functional impact of alternate splicing profile on drug resistance. This technique can pave the way for researches in the field of molecular pharmacology to explore genome-wide determinants of drug resistance.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

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Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

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환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

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Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Non-Radioactive Chemiluminescence Detection을 사용한 텔로미어 길이 정량화

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

저자 스포트라이트: TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 파라미터 최적화  

TAGGG 텔로미어 길이 분석의 성능 매개변수 최적화

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...