Name: an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

모든 실험 절차는 신시내티 아동 연구 재단에서 기관 동물위원회에 의해 승인되었다. 사개월 - 본 연구를 위해, 조혈 줄기 세포는 2 세 C57BL / 6 타고난 쥐의 골수로부터 분리 하였다. CD34 - - 게이팅 전략 리니지, C-키트, 무서-1 등 다양한 표면 업체와 BM의 염색 후 FACS를 사용하여 정렬 셀, FLT3 및 CD34는 선형 적 무서-1 + C-키트 + FLT3에 따라 HSC의 정제에 사용 된 표준 프?...

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	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

이 방법은 에반스에게 블루 염색을 사용하여 아가 로스 탈수, 수지 삽입하는 동안 작은 세포 펠렛을 국산화 삽입 및 프로세스를 절편으로, 낮은 세포 수에 TEM 분석을 할 수 있습니다. 중요한 것은 함께 세포 클러스터를 유지하고 데이터의 정량화를위한 ​​여러 셀을 검사하는 것이 바람직하다 셀 울트라 구조를 유지합니다. TEM 연구에서, 세포 수백만를 함유하는 세포 펠렛?...

세포의 구조 및 울트라 서브 소기관 정보는 주로 투과형 전자 현미경 (TEM) 조직 또는 세포 펠렛으로부터 1,2- 연구에 의해 밝혀왔다. 조직의 단단한 부분은 쉽게 전자 현미경 연구에 이용 될 수있다. 그러나, TEM은 서스펜션의 셀에 1,3 도전을 유지하고 높은 세포 즉, 숫자, 세포의 수백만을 필요로 분석한다. 이 때문에, 서스펜션 희귀 세포 집단의 초 구조 해석은, 예를 들면, 조혈 세포 (조혈 모세포)를 용이하게 평가되지 않는다. cytospin 또는 단일 층 방법을 사용하여 부족한 샘플에서 TEM 분석을위한 여러 시도는 세포의 제한된 수의에서 중요한 정량적 데이터를 얻기 위해 실패합니다. 따라서, 높은 세포 수의 요구 희귀 세포 집단의 세포 내 미세 내용을 이해하는 강력한 도구의 사용을 제한한다. 셀의 한정된 수의 TEM 연구에 중요한 제약현탁액에서의 처리를 위해 셀의 위치 파악하고 이에 따라, 특히 작은 크기의 제한 셀로부터 TEM 연구 도전 남아있다. 여러 가지 다른 접근 방식이 한계에 대응하기 위해 채택 된 다음 BSA / 비스 아크릴 아미드 (BSA-BA) 세포 현탁액의 매개 중합, 커버 슬립을 포함하는 박막 지원에 그들을 볼 수 있도록하는 염료와 세포의 염색, 및 TEM은 cytospin 준비 4-6에서 분석한다. 소수의 세포가 매우 절편 이후 섹션에서 발견 된 그러나, 매우 제한된 성공은 달성되었다. 세포 단층이 절편의 응고 겔의 대부분은 눈에 보이지 않는 남아 있기 때문에 스파 스 세포를 식별의 주요 과제는 지속됩니다. 또한, 세포의 제조 cytospin 인해 셀 확산 셀 구조의 취약성 그들의 세포 조직을 변경할 수있다. 따라서, 이러한 본질적인 결점 더 희귀 한 세포 집단에서 TEM 연구를 수행하는 신규 한 방법을 보증일관성. 이러한 문제를 극복하기 위해, 희귀 세포 집단 (7)로부터의 TEM 연구를위한 새로운 대안 샘플 제조 방법을 설명 하였다. 여기서는 일관성 정량적 결과 부족한 생물학적 시료에서 TEM을 수행하는 효율적인 샘플 준비 프로토콜을보고한다. 에반스 블루 염색 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 남아있을 것입니다 적은 수의 세포, 즉, 만 골수 조혈 줄기 및 전구 세포에서 작은 세포 펠렛을 국산화 고정 후에 수행하고, 펠릿을 탈수 수지 매립 처리 전에 아가로 오스에 포함되었다. 이 방법은 함께 세포 클러스터와 미세 구조 및 LIN (식별 - 무서-1 + 형 c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC) 조혈 줄기 세포의 세포 내 기관의 효율 분석 가능 드문 0.2-0.5 %의 세포 집단을 골수이다. 이 실험 프로로토콜 울트라 구조 연구를 수행하고 희귀하지만 매우 중요한 인구에 대한 정량적 인 결과를 얻기 위해 유용 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">15713</td>
			<td style="width:440px;">CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td>16350</td>
			<td>CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Cacodyladate buffer&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">12300</td>
			<td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4&#176;C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evans Blue&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">E-2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:113px;">A-5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Osmium tetraoxide&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">19130</td>
			<td>1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LX-112 Embedding Kits (LADD&#174;)</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21340</td>
			<td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NMA (Nadic methyl anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21310</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Uranyl acetate (EM Stain I)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">8072820</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ATCC</td>
			<td style="width:113px;">30-2005</td>
			<td>composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramid tip mold&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cylinders</td>
			<td style="width:216px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-microtome&#160;</td>
			<td style="width:216px;">(Leica EM UC7)</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">200 mesh grids (nikil)</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">G-200 Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi model H-7650&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Image capture engine software</td>
			<td>AMT-600&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">72588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials&#160;</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>03-337-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash tool</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Loop tool&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

투과 전자 현미경 (TEM)을 세포 조직과 미세 구조의 세부 사항을 제공한다. 그러나, 이러한 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 희귀 세포 집단, 현탁액, 특히 세포의 TEM 분석에 의한 시료 전처리 동안 높은 세포 수의 요구에 한정 남아있다. 거기에서 부족한 시료 TEM 분석을위한 몇 cytospin 단층 또는 방법이 있지만,이 방법은 셀들의 한정된 수의 상당한 정량 데이터를 얻을 못한다. 여기서, TEM 연구 샘플 준비를위한 다른 신규 한 방법은 정량 분석을 가능 희귀 세포 집단에 대해 설명한다. 비교적 낮은 셀 번호, 즉 10,000 조혈 모세포는 성공적 일반적 TEM 연구에 사용되는 세포의 수많은 비교 TEM 분석에 사용 하였다. 특히, 에반스 블루 염색은 파라 포름 알데히드 - 글루 타르 알데히드 후 작은 세포 화소를 시각화 (PFA-GA) 고정을 시행 하였다아가로 오스에 포함 촉진하는 수 있습니다. 수많은 세포의 클러스터 초박형 섹션에서 관찰되었다. 세포는 잘 보존 된 형태가 있고, 골지 복잡하고 여러 미토콘드리아의 초 구조 세부 사항을 볼 수 있었다. 이 효율적 쉽게 재현 프로토콜은 저 세포 수의 샘플을 제조 할 수 있으며 제한되는 생물학적 시료에서 희귀 세포 집단에 정량적 TEM 분석을 위해 사용될 수있다.

샘플 준비에 대한 효율적이고 일관성 프로토콜은 세포의 낮은 숫자는 설명의 TEM 분석을 수행한다. 에반스 블루와 0.5 ml의 microcentrifuge 관에 세포의 이동과 후 고정 염색은 작은 세포 펠렛 7을 시각화 도움을 주었다. 아가로 오스의 산화 오스뮴과 Osmification는 탈수 및 매립 동안 어두운 세포 펠렛의 쉬운 검출되었다. 작?...

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

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