Name: an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

Tüm deney prosedürleri Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı kurumsal hayvan komitesi tarafından onaylandı. 4 ay - Bu çalışma için, hematopoetik kök hücreler 2 yaşlı C57BL / 6 kendilenmiş farelerin kemik iliğinden izole edilmiştir. CD34 - - Ayırıcı stratejisi soy c-Kit, Sca-1 de dahil olmak üzere farklı yüzey makinesi BM&#39;nin lekelemeden sonra FACS ile tasnif Celi, Flt3 ve CD34 Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 göre HSC saflaştırılması için kullanılmışt...

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

Bu yöntem, Evans mavisi boyama kullanarak ve agaroz dehidratasyon, reçine gömme sırasında küçük bir hücre pelletini lokalize gömme ve süreçleri kesit ile, düşük hücre sayıları TEM analizi sağlar. Daha da önemlisi, bu arada, hücre kümeleri korur ve verilerin ölçümü için çok sayıda hücreleri incelemek için arzu edilir, hücre ultra yapısını korur. TEM çalışmalarda, milyonlarca hücreleri ihtiva eden bir hücre pelleti genellikle çok sayıda hücre veri eld...

Hücrelerin Ultra yapısal ve alt organel ayrıntıları ağırlıklı transmisyon elektron mikroskobu (TEM) doku veya hücre pelet 1,2 dan çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. dokuların katı parçaları kolayca elektron mikroskopisi çalışmaları için kullanılabilir. Ancak, TEM süspansiyon hücreleri üzerinde 1,3 zorlu kalır ve yüksek hücre yani sayıları, hücrelerin milyonlarca gerektiren analiz eder. Bu nedenle, süspansiyonun nadir hücre popülasyonlarının ultra yapısal analizi, örneğin, hematopoietik kök hücreler (HSC), kolayca değerlendirilmemektedir. sitospin veya tek katmanlı yaklaşımları kullanarak kıt örneklerden TEM analizi için birden fazla girişimleri hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Bu nedenle, yüksek hücre sayısı gereksinimi nadir hücre popülasyonlarının hücre içi ultrastrüktürel detaylarını anlamak için bu güçlü aracın kullanımını sınırlar. Hücrenin sınırlı sayıda TEM çalışmalar için önemli bir sınırlamasısüspansiyondaki s işleme hücre lokalizasyonu ve bu nedenle, özellikle küçük boyutları ile sınırlıdır hücrelerden TEM çalışmaları zor olmaya devam etmektedir. Birkaç alternatif yaklaşımlar bu sınırlama karşı kabul edilmiştir: BSA / bisakrilamid (BSA-BA) hücre süspansiyonu aracılı polimerizasyon, lamelleri içeren ince bir film desteğine onları görünür hale getirmek için bir boya ile hücrelerin boyanması, ve TEM sitospin hazırlıkları 4-6 analizleri. Çok az sayıda hücre ultra kesit sonra bölümlerde bulundu Ancak, çok sınırlı bir başarı elde edilmiştir. Hücre tek tabaka kesit için katılaşmış jel çoğunlukla görünmez kalır çünkü seyrek hücrelerin belirlenmesi önemli zorluk devam etmektedir. Ayrıca, hücrelerin Sitospin hazırlanması nedeniyle hücre yayılması ve hücre yapısının kırılganlık kendi hücresel organizasyonu değiştirebilir. Bu nedenle, bu doğal sakıncaları daha nadir hücre popülasyonlarının TEM çalışmaları yapmak için yeni bir yaklaşım garantitutarlılık. Bu sorunu aşmak için, nadir bir hücre popülasyonlarının 7 TEM çalışmalar için bir yeni ve alternatif örnek hazırlama yöntemi tanımlamaktadır. Burada, tutarlı nitel ve nicel sonuçları ile kıt biyolojik örneklerden TEM gerçekleştirmek için etkili bir örnek hazırlama protokolü sunduk. Evans mavisi boyama, aksi takdirde görünmez kalacaktı düşük sayı hücreleri, yani 10.000 kemik iliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden küçük bir hücre pelletini yerelleştirilmesine fiksasyon sonra yapıldı ve pelet dehidratasyon ve reçine gömme süreçlerine önce agaroz içine gömülü edildi. Bu yöntem bir arada hücreleri kümeleri ve ultrastrüktürü ve (Lin olarak tanımlanan - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC) hematopoetik kök hücrelerin hücre içi organizasyonun verimli analiz sağlar, nadir 0,2-0,5% hücre popülasyonu kemik iliğinde. Bu deneysel protokol ultra yapısal çalışmalar yapmak ve çok nadir ama çok önemli popülasyonları üzerindeki nicel sonuçlar elde etmek yararlı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">15713</td>
			<td style="width:440px;">CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td>16350</td>
			<td>CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Cacodyladate buffer&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">12300</td>
			<td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4&#176;C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evans Blue&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">E-2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:113px;">A-5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Osmium tetraoxide&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">19130</td>
			<td>1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LX-112 Embedding Kits (LADD&#174;)</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21340</td>
			<td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NMA (Nadic methyl anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21310</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Uranyl acetate (EM Stain I)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">8072820</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ATCC</td>
			<td style="width:113px;">30-2005</td>
			<td>composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramid tip mold&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cylinders</td>
			<td style="width:216px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-microtome&#160;</td>
			<td style="width:216px;">(Leica EM UC7)</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">200 mesh grids (nikil)</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">G-200 Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi model H-7650&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Image capture engine software</td>
			<td>AMT-600&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">72588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials&#160;</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>03-337-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash tool</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Loop tool&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), hücresel organizasyon ve ultrastrüktürü ayrıntılı bilgi sağlar. Bununla birlikte, bu hematopoietik kök hücreler (HSC), nadir hücre popülasyonlarının, süspansiyon içinde, özellikle hücre TEM analizi, numune hazırlanması sırasında yüksek hücre sayısı şartı ile sınırlı kalmaktadır. Orada kıt örneklerden TEM analizi için birkaç sitospin veya tek katmanlı yaklaşımlar vardır, ancak bu yaklaşımların hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Burada, TEM çalışmalarda numune hazırlanması için bir seçenek ve yeni bir yaklaşım kantitatif analiz sağlar nadir hücre popülasyonları için tarif edilmektedir. Nispeten düşük bir hücre sayısı, yani, 10,000 HSC hücreleri, başarılı bir şekilde, tipik olarak, TEM çalışmaları için kullanılan hücrelerin, milyonlarca göre TEM analizi için kullanıldı. Özellikle, Evans mavisi boyama paraformaldehit-glutaraldehit sonra minik hücre PEL görselleştirmek için (PFA-GA) tespit yapıldıAgaroz gömme kolaylaştırdı, izin verin. Çok sayıda hücre kümeleri, ultra ince bölümler tespit edilmiştir. Hücreler iyi korunmuş morfolojiye vardı ve Golgi kompleksi ve çeşitli mitokondri ultra-yapısal ayrıntıları görünür. Bu, etkin olarak kolay ve tekrarlanabilir bir protokol, düşük hücre sayısı örnek hazırlama izin verir ve sınırlı biyolojik numunelerden nadir hücre popülasyonları üzerinde nitel ve nicel TEM analizi için kullanılabilir.

Numune hazırlama için verimli ve tutarlı protokol hücrelerin sayısının düşük açıklanan TEM analizi gerçekleştirmek için. Evans mavisi ve 0.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri transferi ile post-fiksasyon boyama minik hücre pelletini 7 görselleştirmek yardımcı oldu. Agaroz osmiyum tetraoksit ile Osmification dehidrasyon ve gömme sırasında koyu renkli hücre peleti kolay bir algılama yol açtı. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Altın Nanopartiküller ve Lipid Membranları Arasındaki Isı Transferini İzlemek için Bağlı Bilayer Lipid Membranları

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...