Name: silac based proteomic characterization of exosomes from hiv-1 infected cells
Uploaded: 2017-03-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل الملحق الأذربيجانية إلى عمر / تافتس / براون CFAR، P30AI042853-13S1، المعاهد الوطنية للصحة P20GM103421، P01AA019072، R01HD072693، وK24HD080539 إلى BR. وأيد هذا العمل أيضا من قبل صندوق عمر الطيار البحوث (# 701- 5857)، رود ايلاند مؤسسة أبحاث الطبية غرانت (# 20133969)، والمعاهد الوطنية للصحة كوبر أوري / RIH الطيار منحة بحثية (P20GM104317) لML. نشكر جيمس Myall وVY دانغ للمساعدة في إعداد المخطوط والشكل.

1. خلية ثقافة وHIV-1 العدوى ملاحظة: قبل البدء في التجارب، فمن المستحسن أن تحقق بقاء الخلايا من خلال تلطيخ التريبان الأزرق 11 وانتشارها من خلال فحص MTT 12. ومن الأهمية بمكان استخدام أعدت حديثا المتوسطة SILAC أيضا. خ?...

<ol>
	<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane.">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li><li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits.">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells.">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins.">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis.">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li><li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li><li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus.">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).</li><li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2001).</li><li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics.">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin.">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry.">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication.">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li><li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells.">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li><li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics.">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta:+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo.">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EVpedia:+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research.">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1,+human+protein+interaction+database+at+NCBI.">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).</li><li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunRich:+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool.">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2011:+functional+interaction+networks+of+proteins,+globally+integrated+and+scored.">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2006).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+pure+are+your+vesicles.">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li><li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages.">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li><li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics:+an+overview.">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li></ol>

في الإجراءات الموضحة في هذه الورقة، أثبتنا تطبيق تقنية SILAC لدراسة تأثير الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 1 على بروتيوم exosomal المضيف. في البداية، الخلايا المصابة غير المصابة وHIV-1 هي تفاضلي المسمى النظير. ثم يتم تنقيته من exosomes المسمى تفاضلي قبل تنفيذ استخراج البروتين....

العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك العدوى الفيروسية، غالبا ما ترتبط مع العمليات الخلوية المميزة التي تحدث في وحول الخلايا المتضررة. والبروتينات، وغالبا ما يتصرف مثل مؤثرات الخلوية في نهاية المطاف، توسط هذه العمليات. تحليل البروتينات في كثير من الأحيان يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن بالنسبة للبيئة المحلية من الخلايا المتضررة وتساعدنا على فهم آلية الكامنة وراء المرض والتسبب. بين مختلف تقنيات تحليل البروتين والبروتينات واعدة للغاية بشكل خاص. كما قوية، أداة واسعة النطاق، يمكن أن البروتينات توفير فهم النظامية من العمليات الخلوية، وخاصة في مجال الوظيفة وتفاعل البروتينات. تحليل بروتينات معينة يتم بساطة من خلال تطوير تقنيات وضع العلامات، والتي تسمح للمحققين لمراقبة تعبير عن المكونات الخلوية، وخاصة البروتينات، في موقع التحقيق. وعلى الرغم من تنفيذ العديد من التحليلات البروتين في الخلويوقد ثبت على نطاق وبروتيوم، الأوصاف البروتين في المقصورات التحت خلوية أن تكون مفيدة بشكل خاص 1. ويتمثل هذا جيدا في دراسات عدوى HIV-1. Exosomes، 30-100 حويصلات غشاء نانومتر التي يفرزها مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 2، 3، مكونات حاسمة في التواصل بين الخلايا والنقل الجزيئي. تم اكتشافها سابقا للعب أدوار مهمة في HIV-1 في مهدها عملية 4، 5. من خلال الجمع بين تحليل البروتين مع تشريح وظيفي، وجدنا أن exosomes صدر من HIV-1 الخلايا المصابة وتتكون من توقيع البروتين والجزيئات ميناء تنظيمية فريدة ومختلفة من الناحية الكمية التي تؤثر الخصائص الخلوية على الخلايا الاستقبالية، بما في ذلك الخلايا الخلوية وانتشار 6 المجاورة. ووصف الأساليب في هذا البروتوكول،وهي SILAC (نظير مستقر وصفها من قبل الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية) 7 استنادا توصيف البروتين من exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على فهم أفضل المقصورات التحت خلوية أخرى خلال التسبب عن طريق ضبط الضغط التجريبي إلى المقصورة أو جزء من الفائدة محددة وإجراء التغييرات اللازمة للإجراءات وصفها. وبالنظر إلى التطورات الأخيرة في طرق البروتين الكمي، وهناك الكثير للاختيار من بينها عند اختيار الأسلوب الأكثر فعالية لإجراء تجربة معينة. ومن بين هذه iTRAQ القائمة على المواد الكيميائية (العلامات إسوي الضغط لتقدير النسبي والمطلق) (8) وMRM خالية من التسمية (مراقبة رد فعل متعددة) 9 التقنيات. كلتا الطريقتين هي أدوات قوية وهي خيارات جيدة لإعدادات محددة. لمختبر نموذجي يعمل أساسا مع خطوط الخلايا، ومع ذلك، وهذه الأساليب لهما relativelذ ارتفاع التكاليف وأكثر بالمقارنة مع طريقة تقوم SILAC تستغرق وقتا طويلا. SILAC هو التمثيل الغذائي القائم العلامات التقنية التي تتضمن أشكال النظائر امشع من الأحماض الأمينية من وسائل الإعلام الثقافة في البروتينات الخلوية. عادة، والتجارب SILAC تبدأ مع اثنين من سكان الخلية، على سبيل المثال، المصابة وغير المصابة. كل وصفت بشكل مختلف في بيئة النظائر محددة إلى حين التوصل إلى وضع علامات كاملة. ثم يتعرض للexosomes وصفت هذه الخلايا لاستخراج البروتين. مرة واحدة المستخرج، ويتم تحليل البروتينات exosomal المسمى باستخدام السائل اللوني جنبا إلى جنب الكتلة الطيفي 10. وأخيرا، يتعرض نتائج مطياف الكتلة والبروتينات وصفت بشكل كبير في الإحصائية والمعلوماتية الحيوية ويحلل وكذلك التحقق الكيمياء الحيوية صارم. وتشير تقاريرنا التحقيق السابقة أن الإجراءات SILAC / exosome أكثر ملاءمة للخطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وخطوط الخلايا وعادة ما تكون فيالدولة المتكاثرة نشطة لكفاءة وضع العلامات النظائر،

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">H9 cell line</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:111px;">HTB-176</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">MTT assay kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">V13154</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">Dialyzed fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">26400044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">SILAC Protein Quantitation Kit &#8211; RPMI 1640</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">89982</td>
			<td style="width:168px;">DMEM version (89983)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">88434</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">88431</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">HIV-1NL4-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:121px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:111px;">2480</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit</td>
			<td style="width:121px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NEK050001KT</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Refrigerated super-speed centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:111px;">22628045</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Refrigerated ultracentrifuge</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">363118</td>
			<td style="width:168px;">Should be able to reach 100,000g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">14-432-22</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">326823</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SW 32 Ti Rotor</td>
			<td style="width:121px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">369694</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">89900</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Protease Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">&#160;78430</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">ThermoMixer&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:111px;">5384000020</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">23250</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:121px;">Biorad</td>
			<td style="width:111px;">1702525</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SDS PAGE Gel apparatus</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">EI0001</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td style="width:121px;">Novex</td>
			<td style="width:111px;">XV04200PK20</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gel staining reagent</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1041</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">V5111</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:111px;">SPD131DDA</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Antibody to human annexin A5</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td style="width:111px;">ab14196</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Antibody to human lactate dehydrogenase B chain</td>
			<td style="width:121px;">Abcam</td>
			<td style="width:111px;">ab53292</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:227px;">Graphing and Statistical Software</td>
			<td style="width:121px;">Systat&#160;</td>
			<td style="width:111px;">SigmaPlot&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Or GraphPad Prism</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Quantitative proteomics software suite</td>
			<td style="width:121px;">Max Planck Institue of Biochemistry</td>
			<td style="width:111px;">Maxquant&#160;</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Software and databases</td>
			<td style="width:121px;">Various vendors</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:168px;">Refer to main text for details</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silac based proteomic characterization of exosomes from hiv-1 infected cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

الشكل 1A هو مخطط يحدد SILAC وضع العلامات الإجراء 21. من أجل تنقية exosomes، لا بد من نسج عينات أسفل عن طريق الطرد المركزي. ويبين الشكل 1B خطوات تنقية exosome بواسطة تنبيذ فائق التسلسلي 21. مرة واحدة تنقيته، وexosomes تخضع لت?...

Watch this Scientific Journal Video about SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells at JoVE.com

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells (Video) | JoVE

هنا، نحن تصف طريقة البروتينات الكمي باستخدام تقنية مستقرة وصفها النظائر عن طريق الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية (SILAC) لتحليل آثار عدوى HIV-1 على proteomes exosomal المضيف. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى الخلايا تحت مختلف الإجهاد أو الإصابة الظروف.

SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein (Video) | JoVE

تمييز خلايا محددة HIV - 1 الإيجابية باستخدام المتجهات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral وإذ تعرب عن البروتين الأخضر نيون

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3 (Video) | JoVE

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays (Video) | JoVE

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays (Video) | JoVE

تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores (Video) | JoVE

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals (Video) | JoVE

أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. (Video) | JoVE

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay (Video) | JoVE

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals (Video) | JoVE

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes (Video) | JoVE

تصور HIV-1 الكمامة ملزم لالعملاق Unilamellar الحويصلة (GUV) الأغشية

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...