Name: preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue at JoVE.com

Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

הפרוטוקול הבא אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) באונ&#39; ניו אינגלנד. פרוטוקול להלן להכנת תרבויות גליה מ -4 מיתרי השדרה עכבר בוגר. 1. הכנת פתרונות במנדף תרבות בתנאי aseptic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;dir...

<ol>
	<li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+pain:+Is+chronic+pain+a+gliopathy?.">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?.</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li><li>Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

זה קריטי כדי לבצע את כל השלבים, כולל בתקשורת שינוי לוח זמנים-באופן עקבי על מנת לקבל תוצאות לשחזור בין ניסויים. השלבים הבאים הם קריטיים במיוחד בהשגת גליה מעורבת מבוגרים באיכות מעולה. עיכול אנזימטי הוא היבט חשוב של פרוטוקול זה. זה ח?...

כאב כרוני הוא בעיה בריאותית חמורה המשפיעה על כ -100 מיליון מבוגרים בארצות הברית, עם עלות שנתית משוערת של עד 635 מיליארדים $ 1. ראיות מצטבר ציינו תרומה משמעותית של תאי גלייה בחוט שדרה בפיתוח בכאב עצבי, אחד המיני ההרסני ביותר של כאב כרוני 2. מערכת תרבות ראויה במבחנה תעזור משמעותית נוספים חוקרים את התפקידים של ותאי גלייה ברמות התאיות ומולקולריות. נכון לעכשיו, מערכות התרבות גליה במבחנה מנוצלות על ידי חוקרים כוללות בעיקר תאי גלייה נגזרו רקמות קליפת מוח של מוח עכבר או עכברוש בילוד והנציחו שורות תאי גליה הנגזרות עכבר בילוד או להלשין ותאי גלייה עיקריים. תאים עובריים מכילים כמויות משמעותיות של תאים שלא עברו התמיינות אשר ניתן להבדיל נוספת לתאי גליה (בעיקר האסטרוציטים ו microglia), ובכך לספקתאי bundant לשימוש 3 ניסיוני. עם זאת, המחקר קודם שלנו הראה כי תאי גלייה בילוד המוח הגיבו באופן שונה משמעותי מתא גליה בחוט שדרה מבוגרת על lipopolysaccharide (LPS) גירוי. לדוגמה, interleukin (IL) -4 מוצג משופרת השפעות מעכבות על תחמוצת החנקן הנגרמת LPS (NO) ב גליה בחוט השדרה עכברוש מבוגר לעומת גליה 4 המוח בילוד. יתר על כן, את הפרופילים של ייצור chemokine על גירוי על ידי neuropeptide, calcitonin פפטיד הקשורים גן (CGRP), הם unarguably שונים בין גליה המוח עכבר בילוד (השיטות המתוארות Ref. 5) ועכבר מבוגר גליה חוט השדרה (איור 1). שורות תאים הוקמו קלות לשימוש ולתחזוקה והוא יכול לספק מספר רב של תאים בתוך פרק זמן קצר. באופן כללי, הנציח שורות תאים נוצרות גם באמצעות מערכת הנצחה וירוס בתיווך (כגון שורת תאים microglial בשימוש נרחב BV2) 6, 7 או ה הבאהדואר זיהוי של טרנספורמציה ספונטנית (כגון שורת תאי astrocyte C8-D1A וקו תא microglial-B4 C8) 8, 9 שורות תאים מצוינות ללמוד את המאפיינים המולקולריים של האסטרוציטים ו microglia בנפרד.; עם זאת, התוצאות שהתקבלו מן שורות תאים תמיד דורשות אימות נוספת תאים ראשוניים או בתנאי in vivo. כמו כן יש לציין כי לא חל דו&quot;ח של קו תא גלייה כי נגזר גליה בחוט שדרה מכרסמת. כדי לסייע בחקירת התפקיד של תאי גלייה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי, מערכת התרבות הנגזרת חוט השדרה עכבר בוגר פותחה על ידי התאמת שיטת בעבר דיווח השתמשו כדי ליצור תרבויות גליה מעורבת חולדה בוגרת 4, 5 . תרבות גליה שדרת כבל העכבר הייתה מעודנת יותר לאחרונה 10 והוא מתואר בפירוט רב יותר במאמר זה. ג תרבויות שדרה למבוגר גליה מעורבת כבלשתוקם עם העכבר זנים נבחרים שמתאימים לצרכים של מחקר מסוים, ותאי יכול להישמר בתרבות עד 21 לפוסט חניכה של התרבות. שיטה זו יכולה לשמש במחקרים כאב נוירופתי, כמו גם בחקירות של מחלות נוירולוגיות שונות שכוללות שינויים פתולוגיים בתוך חוט השדרה, כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) -associated נוירופתיה סנסורית, מרובים טרשת (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

זה כבר טוב כי קיבל תגובות גליה בחוט השדרה לתרום רבות להתפתחות כאב נוירופתי. מידע עצום בנוגע לפעילות גליה ברמות התאיות ומולקולריות הושג באמצעות מערכות תרבות תאים במבחנה. המערכות חוץ הגופייה המנוצלת, כוללות בעיקר גליה עיקרית נגזרה רקמת קליפת מוח מוח בילוד והנציחו שורות תאים. עם זאת, מערכות אלה לא יכולים לשקף את המאפיינים של תאי גלייה בחוט השדרה in vivo. כדי להמשיך לחקור את התפקידים של תאים גליה בחוט השדרה בפיתוח בכאב עצבי-induced פגיעה עצבית היקפית באמצעות מערכת תרבות משקפת טוב יותר את מצב in vivo, במעבדה שלנו פיתחה שיטה להקים תרבויות גליה מעורבת חוט השדרה העיקרי מן עכברים בוגרים. בקצרה, נאספים מיתרי השדרה של עכברים בוגרים ומעובד באמצעות עיכול פפאין ואחריו הסרת המיאלין עם מאורותity-שיפוע בינוני. המתלים תא בודדים בתרבית תקשורת הנשר השונה של שלמה Dulbecco (cDMEM) בתוספת 2-mercaptoethanol (2-ME) ב 35.9 מעלות צלסיוס תנאי תרבות אלה מותאמים במיוחד עבור הצמיחה של תאי גליה מעורבים. בתנאים אלה, תאים מוכנים לשמש לניסויים בין 12 - 14 ד (תאים הם בדרך כלל בשלב יומן במהלך הזמן הזה) לאחר הקמת התרבות (D 0) ו יכולים להישמר בתנאי תרבות עד D 21. מערכת תרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור את התגובות של תאי גלייה בחוט שדרה על גירוי עם חומרי סוכנים שונים. מלבד כאב נוירופתי, מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות גליה במחלות אחרות שכוללות שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט שדרה.

שיטה זו יכולה לשמש כדי להכין ותאי גלייה מעורבים משני עכברים וחולדות. מספר התאים הכולל ממוצע לכל היטב צלחת 12 גם ב -12 D-ייזום פוסט של התרבות צריך להיות יציב יחסית, עם כ 100,000 תאים לכל טוב כאשר תאים נגזרים מייתרי שדרת עכבר. תאי גלייה המתקבלים בשיטה זו ניתן ל...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue at JoVE.com

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

התפתחות כאב נוירופתי כרוך שינויים פתולוגיים של תאי גלייה בחוט השדרה. מערכת תרבות גליה אמינה נגזרה רקמת חוט שדרה מבוגרת ועוצבה ללימוד תאים אלה במבחנה חסרה. לכן, אנו מציגים כאן כיצד להקים תרבויות גליה מעורבות עיקריות מרקמות כבל מבוגר עכבר שדרה.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

The overall goal of this protocol is to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cords for in vitro studies. This method provides us an in vitro system to investigate the roles of glial cells in neurological diseases that involve pathological changes within the spinal cord, such as neuropathic pain and multiple sclerosis. The main advantage of this technique is that the glial cultures are prepared from adult mouse spinal cord, providing a system that is more accurately reflecting the in vivo conditions.Demonstrating the procedure will be Jennifer Malon, a technician from my laboratory. Working in a tissue culture hood, transfer four mouse spinal cords into a petri dish of HBSS. Use sterile scissors and forceps to cut each of the spinal cords into small pieces.Then, transfer the pieces to a 50 millimeter conical tube containing Papain DNAse enzyme mixture. Avoid transferring HBSS to the enzyme mixture, as this may result in decreased performance of the enzyme. It is crucial that tissue pieces are well digested to obtain a single cell suspension.However, over digestion will result in fewer viable cells. Each lab needs to perform pilot tests to determine the exact digestion time based on what works best for their cells. Next, gently vortex the tube and then incubate at 37 degrees Celsius for one hour with orbital shaking at 150 rotations per minute.Following the incubation, vortex the tube, and then vigorously triturate the tissue using a five milliliter pipet to promote further dissociation. Then, transfer the cell suspension into a 15 milliliter tube and centrifuge for 300 x g for five minutes at room temperature. During the centrifugation, at 300 microliters of reconstituted albumin ovomucoid inhibitor solution to 2.7 milliliters of ABSS in a sterile tube and mix well.Then add 150 microliters of DNAse solution. Following the centifugation, remove the supernatant, and resuspend the cell pellet in the freshly prepared albumin ovomucoid inhibitor and DNAse solution. Vortex well to break the cell pellet.Then, add three milliliters of reconstituted albumin ovomucoid inhibitor solution, without DNAse, to the cell suspension. Centrifuge the cells at 70 x g for six minutes at room temperature. After the spin, remove the supernatant, which contains membrane fragments, and retain the pellet.To remove myelin from the dissociated spinal cord cells, first add eight milliliters of room temperature 20%gradient density medium into the tube containing the cell pellet and vortex gently. Next, centrifuge the cells at 800 x g for 30 minutes at room temperature without breaking. Following centrifugation, carefully aspirate the top layer of debris, which contains mostly myelin and the supernatant, leaving the pellet.To remove any remaining density gradient, wash the cells by resuspending the pellet with eight milliliters of cDMEM diluted with HBSS. Centrifuge the cells at 400g for 10 minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant, and wash the cells with diluted cDMEM as before.After removing the supernatant, the pellet can be stored on ice until seeding the cells. Once ready for plating, resuspend the cells in 14 milliliters of cDMEM, supplemented with 2-Mercaptoethanol. And add one milliliter of the cell suspension to each well in a 12 well plate.Plate extra wells that can be used to determine the average cell number per well and the microglial content of the culture. Once the cells have been plated, incubate the cells at 35.9 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Change the medium on day 1, which is the day after plating.Some cells are attached to the culture plate, but they are still mostly round. There are also many floating cells and significant debris. Repeat the media change three to four days thereafter until the cells are ready for treatment between days 12 and 14.Mixed glial cells from adult C57 black six mice were cultured at either 37 degrees Celsius or 35.9 degrees Celsius and analyzed via flow cytometry. As you can see, there is no obvious difference in the total cell populations at these temperatures. These representative plots show the CD45 positive CD11b positive microglia populations isolated from the total cell populations previously shown.This figure demonstrates that a higher microglial content can be obtained when mixed glia are cultured at 35.9 degrees Celsius, instead of 37 degrees Celsius. Adult spinal cord, mixed glial cultures were prepared from C67 black six mice. Representative images of the cultured cells at days one, four, eight, and 12 are shown.Images showing the typical progress of the culture, as well as demonstrating the importance of media, change at day one post-culture establishment. Once mastered, the initial set up of mixed glia cell culture can be completed in about four hours, if performed properly. Following the establishment of mixed glia culture, microglia depleted, and microglia enriched cultures, can be obtained from this initial mixed population.However, the yield of microglia enriched cells will be limited unless large number of spinal cords are used to establish cultures. This technique was initially designed to investigate the roles of glial cells during the development of neuropathic pain. However, it can be used to study other neurological diseases that involve pathological changes within the adult spinal cord.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

מוח עכבר עוברי מעורב תרביות תאים כדי לחקור זיהום וחסינות מולדת

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

מחבר זרקור: ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהום וחסינות מולדת  

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...