Name: preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00
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Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

다음 프로토콜은 뉴 잉글랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 다음 프로토콜은 4 성인 마우스 척수에서 아교 문화를 준비입니다. 무균 조건 하에서 문화 후드에서 솔루션 1. 준비 <ol><li> 배양 배지를 준비 : 이글 미디어 (cDMEM) DMEM을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 100 IU / ㎖ 페니실린 (4.5 g / L의 포도당), 10...

<ol>
	<li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+pain:+Is+chronic+pain+a+gliopathy?.">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?.</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li><li>Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

는 모든 단계를 포함한 실험 간 재현성있는 결과를 얻기 위해 일관된 방식으로 일정 변화 매체를 수행하는 것이 중요하다. 다음 단계는 우수한 품질의 성인 혼합 된 아교 세포를 얻기에 특히 중요하다. 효소 소화는이 프로토콜의 중요한 측면이다. 이 조직 조각을 단일 세포 현탁액을 얻기 위해서 잘 소화하는 것이 중요하다. 그러나, 오버 소화 상당히 적은 세포에서 발생합니...

만성 통증은 최대 $ (635) 10 억의 추정 연간 비용으로, 미국에서 약 1 억 성인에 영향을 미치는 심각한 건강 문제이다. 증거 확보는 신경 병증 통증, 만성 통증이 가장 파괴 한 가지의 개발 척수 신경교 세포의 상당한 기여를 표시하고있다. 적절한 시험 관내 배양 시스템은 세포 및 분자 수준에서 신경교 세포의 역할을 조사 크게 도움이 될 것이다. 현재 연구에서 사용되는 시험 관내 신경교 배양 시스템은 신생아 마우스 또는 쥐의 뇌 피질 조직 유래 주로 아교 세포를 포함하는 불멸화 및 신생아 마우스로부터 유도 된 아교 세포주 또는 일차 신경교 세포를 쥐. 신생아 세포 따라서를 제공, 추가 (주로 성상 세포 및 미세 아교 세포) 신경 교세포로 분화 할 수있는 미분화 세포의 큰 숫자를 포함실험 사용 3 bundant 세포. 그러나, 우리의 이전 연구는 신생아의 뇌 신경 교세포는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극에 성인 척수 아교 세포에서 크게 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 예를 들면, 인터루킨 (IL)는 -4 신생아의 뇌 신경교 4 비교 성숙한 래트 척수에서 신경교 (NO)의 생산 LPS 유도 된 산화 질소에 대한 억제 효과를 강화 표시됩니다. 또한, 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 칼시토닌 신경 펩티드에 의한 자극에 따라 케모카인 생산의 프로파일은, (5. 참고 문헌에 기술 된 방법) 신생 마우스의 뇌 신경교 사이 말할 나위 다른 성인 마우스 척수 신경교 (도 1). 확립 된 세포주를 사용 및 유지 관리가 용이하고 단시간에 다수의 셀을 제공 할 수있다. 일반적으로, 세포주를 생성하거나 6, 7, 또는 다음의 제 (예 널리 사용 소교 세포주 BV2 등) 바이러스 - 매개 불멸화 시스템을 사용하는 불멸화자발 변환의 전자 식별 (예 성상 세포주 C8-D1A 및 소교 세포주 C8-B4)를 8, 9 세포주 개별적 성상 세포 및 미세 아교 세포의 분자 적 특징을 연구하는데 우수하다.; 그러나, 세포주에서 얻어진 결과는 항상 주요 세포 또는 생체 내 조건에서의 추가 확인을 요구한다. 또한 설치류의 척수 아교에서 유래하는 아교 세포주 보고서가 없었던 것을 주목해야한다. 신경 병증 성 통증, 성인 쥐 혼합 신경교 배양 (4)를 생성하는 데 사용되는 이전에보고 된 방법을 적용하여 개발 된 성인 마우스 척수로부터 유래 배양 시스템 (5)의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하는 데 도움 . 마우스 척수 폐해 문화는 더 최근에 (10)를 정제하고,이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 성인 척수 혼합 폐해 문화의 C는 특정 연구의 요구에 맞게 선택된 균주로부터 마우스를 확립하고, 세포를 배양 개시 게시 d는 최대 21 명까지 배양 유지할 수있다. 이 방법뿐만 아니라 -associated 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감각 신경 병증, 복수 등의 척수 내 병리학 적 변화를 포함하는 다양한 신경 질환의 연구에서, 신경병 통증의 연구에 사용될 수있다 경화증 (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

척수 신경교 반응은 신경 병증 통증의 발전에 크게 기여하는 것이 잘 인정되었다. 세포 및 분자 수준에서 신경교 활동에 대한 상당한 정보를 시험 관내 세포 배양 시스템을 통해 얻어진다. 사용 된 시험 관내 시스템은 주로 신생아의 뇌 피질 조직으로부터 유도 된 일차 신경교 포함 및 세포주 불멸. 그러나, 이러한 시스템은 생체 내에서 척수 신경교 세포의 특성을 반영하지 않을 수있다. 더 나은 생체 상태를 반영 배양 시스템을 이용하여 말초 신경 손상 - 유도 된 신경 병증 통증의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하기 위해, 우리 실험실에서 기본 척수 혼합 신경교 배양을 설정하는 방법을 개발했다 성인 마우스. 간단히, 척수는 성인 쥐에서 수집하고 굴과 수초 제거하여 파파인 소화를 통해 처리됩니다성만 구배 매체. 단일 세포 현탁액은 35.9 오 ℃에서 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME) 보충 완전한 둘 베코의 변형 이글 미디어 (cDMEM)에서 배양 이러한 배양 조건은 혼합 아교 세포의 성장을 위해 특별히 최적화된다. 이러한 조건 하에서, 셀 (12) 사이의 실험에 사용될 준비가 - 14 일 배양의 설립 (D 0) 후 (셀이 기간 동안 로그 단계에서 일반적 임) 및 D (21)까지의 배양 조건에서 유지 될 수있다. 이 배양 시스템은 다양한 물질 및 제제로 자극시 척수 신경교 세포의 반응을 조사하기 위해 사용될 수있다. 신경 병성 통증 외에,이 시스템은 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 포함하는 다른 질병의 폐해 반응을 연구하는데 사용될 수있다.

이 방법은 마우스 및 래트에서 모두 혼합 아교 세포를 제조 할 수있다. 세포가 마우스 척수에서 파생 된 때 문화의 D (12) 이후 개시에 12 웰 플레이트에 웰 당 평균 총 세포 수는 물론 당 약 10 만 세포와 상대적으로 안정해야한다. 이 방법에서 얻은 신경교 세포 물질 및 관심 제의 투여시 성인 척수 신경교 응답을 검사하도록 설계된 실험에 사용될 수있다. (3)가 ?...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

The overall goal of this protocol is to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cords for in vitro studies. This method provides us an in vitro system to investigate the roles of glial cells in neurological diseases that involve pathological changes within the spinal cord, such as neuropathic pain and multiple sclerosis. The main advantage of this technique is that the glial cultures are prepared from adult mouse spinal cord, providing a system that is more accurately reflecting the in vivo conditions.Demonstrating the procedure will be Jennifer Malon, a technician from my laboratory. Working in a tissue culture hood, transfer four mouse spinal cords into a petri dish of HBSS. Use sterile scissors and forceps to cut each of the spinal cords into small pieces.Then, transfer the pieces to a 50 millimeter conical tube containing Papain DNAse enzyme mixture. Avoid transferring HBSS to the enzyme mixture, as this may result in decreased performance of the enzyme. It is crucial that tissue pieces are well digested to obtain a single cell suspension.However, over digestion will result in fewer viable cells. Each lab needs to perform pilot tests to determine the exact digestion time based on what works best for their cells. Next, gently vortex the tube and then incubate at 37 degrees Celsius for one hour with orbital shaking at 150 rotations per minute.Following the incubation, vortex the tube, and then vigorously triturate the tissue using a five milliliter pipet to promote further dissociation. Then, transfer the cell suspension into a 15 milliliter tube and centrifuge for 300 x g for five minutes at room temperature. During the centrifugation, at 300 microliters of reconstituted albumin ovomucoid inhibitor solution to 2.7 milliliters of ABSS in a sterile tube and mix well.Then add 150 microliters of DNAse solution. Following the centifugation, remove the supernatant, and resuspend the cell pellet in the freshly prepared albumin ovomucoid inhibitor and DNAse solution. Vortex well to break the cell pellet.Then, add three milliliters of reconstituted albumin ovomucoid inhibitor solution, without DNAse, to the cell suspension. Centrifuge the cells at 70 x g for six minutes at room temperature. After the spin, remove the supernatant, which contains membrane fragments, and retain the pellet.To remove myelin from the dissociated spinal cord cells, first add eight milliliters of room temperature 20%gradient density medium into the tube containing the cell pellet and vortex gently. Next, centrifuge the cells at 800 x g for 30 minutes at room temperature without breaking. Following centrifugation, carefully aspirate the top layer of debris, which contains mostly myelin and the supernatant, leaving the pellet.To remove any remaining density gradient, wash the cells by resuspending the pellet with eight milliliters of cDMEM diluted with HBSS. Centrifuge the cells at 400g for 10 minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant, and wash the cells with diluted cDMEM as before.After removing the supernatant, the pellet can be stored on ice until seeding the cells. Once ready for plating, resuspend the cells in 14 milliliters of cDMEM, supplemented with 2-Mercaptoethanol. And add one milliliter of the cell suspension to each well in a 12 well plate.Plate extra wells that can be used to determine the average cell number per well and the microglial content of the culture. Once the cells have been plated, incubate the cells at 35.9 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Change the medium on day 1, which is the day after plating.Some cells are attached to the culture plate, but they are still mostly round. There are also many floating cells and significant debris. Repeat the media change three to four days thereafter until the cells are ready for treatment between days 12 and 14.Mixed glial cells from adult C57 black six mice were cultured at either 37 degrees Celsius or 35.9 degrees Celsius and analyzed via flow cytometry. As you can see, there is no obvious difference in the total cell populations at these temperatures. These representative plots show the CD45 positive CD11b positive microglia populations isolated from the total cell populations previously shown.This figure demonstrates that a higher microglial content can be obtained when mixed glia are cultured at 35.9 degrees Celsius, instead of 37 degrees Celsius. Adult spinal cord, mixed glial cultures were prepared from C67 black six mice. Representative images of the cultured cells at days one, four, eight, and 12 are shown.Images showing the typical progress of the culture, as well as demonstrating the importance of media, change at day one post-culture establishment. Once mastered, the initial set up of mixed glia cell culture can be completed in about four hours, if performed properly. Following the establishment of mixed glia culture, microglia depleted, and microglia enriched cultures, can be obtained from this initial mixed population.However, the yield of microglia enriched cells will be limited unless large number of spinal cords are used to establish cultures. This technique was initially designed to investigate the roles of glial cells during the development of neuropathic pain. However, it can be used to study other neurological diseases that involve pathological changes within the adult spinal cord.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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연구

신경과학

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This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위한 배아 마우스 뇌 혼합 세포 배양

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

저자 스포트라이트: 감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 마우스 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교세포 배양 확립  

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...