Name: visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00
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TB reconnaît une bourse de recherche de Fibrose kystique Canada.

Notez que Comité d&#39;éthique de la recherche (CER) est nécessaire pour recueillir et stocker des échantillons de crachats de sujets humains. Ces études ont été approuvées par le Hospital for Sick Children REB # 1000019444. 1. Préparation des échantillons d&#39;expectoration CF <ol><li> Prélever un échantillon de crachat de patients au cours des visites de routine à la clinique de fibrose kystique et de garder sur la glace. </li><li> Transports échantillon de crachat sur la ...

<ol>
	<li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+with+biofilm+formation:+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy.">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation:+a+clinically+relevant+microbiological+process.">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario,+Canada.">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li><li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis.">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li><li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells.">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa.">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li><li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses.">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).</li><li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li><li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms.">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li><li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients.">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide.">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).</li></ol>

Les procédés décrits ici permettent une visualisation des biofilms bactériens cultivés en présence de produits exogènes. Sans surprise, la production des exoproducts est d&#39;une importance lors de l&#39;utilisation de ce type de système. Par exemple, dithiothréitol (DTT), est souvent utilisé sur des échantillons de crachats humains pour aider à liquéfier les échantillons. Cependant, l&#39;effet de DTT seul peut réduire le développement de biofilm et la viabilité (données non présentées). Ainsi, des...

biofilms bactériens sont des groupes de micro-organismes qui sont reliés les uns aux autres et enfermés dans une matrice auto-sécrété. 1,2 Classiquement, ils représentent les bactéries physiquement attachés à une surface abiotique ou biotique formé dans des conditions d&#39;écoulement. Biofilms ont également été montré à croître dans des conditions statiques (absence d&#39;écoulement) et distal par rapport à des surfaces, par exemple à l&#39;interface air-liquide des piscines thermales ou aux pellicules formées dans des tubes à essai. Ces biofilms sont reconnus depuis longtemps dans l&#39;environnement et sont un préjudice important aux procédés industriels, car ils peuvent se former dans les réservoirs d&#39;eau ou dans les tuyaux, ce qui entraîne l&#39;encrassement biologique, la corrosion et les blocages. 3,4 Les biofilms sont également critiques dans les milieux de soins de santé, comme il a été démontré être impliqués dans les infections liées au cathéter, les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique, ainsi que dans de nombreuses autres infections. 5,6 L&#39; une des caractéristiques des infections biofilm est le deaugmenté la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et une altération de la clairance par le système immunitaire inné. 7-9 Le plus bien étudiés, des scénarios cliniquement pertinentes impliquant une infection à base biofilm se produit chez les patients atteints de fibrose kystique (FK), qui sont chroniquement infectés par Pseudomonas biofilms aeruginosa. P. aeruginosa peut subir un certain nombre de changements lors de l&#39; établissement d&#39; une infection chronique qui le rendent très difficile à traiter. 10,11 biofilms peuvent différentiellement activer l&#39; immunité innée et conduire l&#39; inflammation. 12-14 Comme ces infections conduisent à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose, il est essentiel de comprendre les facteurs qui peuvent influer sur le développement du biofilm dans ce contexte. Une étude récente suggère que l&#39; hôte facteurs sont essentiels à la formation de P. aeruginosa agrégats de biofilm. 15 Ces biofilms contribuent à une sensibilité réduite aux antibiotiques et les mécanismes de défense de l&#39; hôte. Le presence de facteurs dérivées de l&#39;hôte, telles que l&#39;élastase neutrophile, ainsi que les produits sécrétés à partir de micro-organismes présents dans le poumon CF, ont la capacité de moduler considérablement la formation de biofilm et de développement. 16 En outre, les biofilms interagir avec l&#39;hôte pour moduler l&#39; expression de nombreuses voies et initier l&#39; inflammation. Bien que les méthodes à haut débit, tels que le test de cristal violet standard, peuvent fournir des informations en ce qui concerne le processus de biofilm, la visualisation du biofilm en réponse à ces facteurs fournissent plus d&#39;informations en profondeur. Dans ce manuscrit , nous décrivons une méthode d&#39;utilisation des facteurs de l&#39;expectoration des patients atteints de mucoviscidose pour étudier le développement de biofilms in vitro. Cette méthode permet une visualisation rapide des biofilms exposés à des crachats contenant des facteurs de l&#39;hôte en utilisant un kit biofilm viabilité commerciale. Cette technique peut être utilisée pour identifier visuellement des changements qui se produisent lors de la croissance du biofilm en présence d&#39;exógenonous produits, et représente une méthode améliorée pour analyser les changements dans le développement du biofilm dans diverses conditions.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Sicher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">155409</td>
			<td style="width:729px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">L10316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Blood agar plates</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">R10215</td>
			<td>Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">COMSTAT</td>
			<td style="width:159px;">Availble software online</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Millers LB Broth</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12780-052</td>
			<td style="width:729px;">Standard media for overnight gowth/biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex-GV Syringe Filters</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td>Filtering of sputum supernants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td style="width:159px;">Oxoid</td>
			<td style="width:136px;">BR0014G</td>
			<td>Washing of biofilm chambers after media removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss AxioVert 200M</td>
			<td style="width:159px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td>
			<td style="width:159px;">QS Technologies Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectral Borealis</td>
			<td style="width:159px;">Qs Technologies Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perkin Elmer Volocity</td>
			<td style="width:159px;">QS Technologies Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model

Les biofilms sont constitués de groupes de bactéries enrobées dans une matrice auto-sécrété. Ils jouent un rôle important dans la contamination industrielle, ainsi que dans le développement et la persistance de nombreuses infections liées à la santé. Un des biofilms plus bien décrits et étudiés dans les maladies humaines se produit dans l&#39;infection pulmonaire chronique des patients atteints de fibrose kystique. Lors de l&#39;étude des biofilms dans le contexte de l&#39;hôte, de nombreux facteurs peuvent influer sur la formation et le développement de biofilm. Afin d&#39;identifier comment les facteurs de l&#39;hôte peuvent affecter la formation de biofilm et de développement, nous avons utilisé une méthode coverglass chambré statique de croître biofilms en présence de facteurs de l&#39;hôte dérivé sous forme de surnageants d&#39;expectorations. Les bactéries sont ensemencées dans des chambres et exposées à filtrats expectorations. À la suite de 48 h de croissance, les biofilms sont colorées avec un kit de viabilité commerciale du biofilm avant la microscopie et l&#39;analyse confocale. Suite à l&#39;acquisition de l&#39;image, les propriétés biofilm peuvent être évaluées en utilisant différentes plates-formes logicielles.Cette méthode nous permet de visualiser les propriétés clés de la croissance du biofilm en présence de différentes substances, notamment des antibiotiques.

La conception d&#39; ensemble de l&#39;expérience est représenté sur la figure 1. L&#39;utilisation de ce protocole fournit une méthode pratique pour visualiser les changements dans les biofilms cultivés pour différentes périodes de temps (par exemple, 24, 48 ou 72 h). Surtout, des signaux exogènes tels que des crachats filtrats peuvent être ajoutés pour visualiser les changements dans le développement du biofilm. Comme on le voit sur la figur...

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Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

The overall goal of this procedure is to visualize and quantify changes to biofilms in response to sputum and antibiotics. This method can be used by researchers to understand key questions, such as how the efficacy of various antibiotics against bacterial biofilms can be impacted by the presence of sputum. The main advantage of this methodology is it allows individuals to see changes occurring in biofilms in response to different factors.To begin the experiment, record the volume of the previously obtained sputum sample. Add phosphate-buffered saline, or PBS, add two times the volume of the sample. Next, use a transfer pipette to thoroughly mix the sample.Vortex the sample on the highest setting for one minute to mix it completely. Aliquot one milliliter of the mixture into 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. Then spin down the tubes.Following centrifugation, save the supernatant and discard the pellet. Filter sterilize the supernatant through a 0.22 micron filter and collect it in a clean microcentrifuge tube. Store the sputum supernatant at 80 degrees Celsius for future use.Place 40 microliters of previously prepared culture into four milliliters of fresh Luria broth, or LB media, and grow the bacteria to obtain a culture with an optical density of 0.55 at 600 nanometers. Next, dilute 100 microliters of 0.5 OD culture into 400 microliters of prepared 10%sputum filtrates in LB.Use 200 microliters of the dilution to seed the wells of the slide chambers. Allow the bacteria to attach for four hours at 37 degrees Celsius without shaking.After four hours, remove the media and gently wash the biofilm with 1X fresh LB.Replace the remaining media with 200 microliters of fresh LB.Allow the biofilms to grow at 37 degrees Celsius without shaking. Replace the media every 12 hours without washing until the biofilm is ready for microscopy. It's very important to gently wash the slides so as not to disrupt any attached bacteria.Following growth, remove the media from the chamber wells and gently wash each chamber two times with 300 microliters of sterile PBS. Next, to prepare the biofilm staining mixture, add one microliter of each dye provided in the viability kit to each milliliter of solution needed and mix the solution. The optimal amount of dye and staining time is determined empirically for each organism.Add 200 microliters of the staining mixture to each well of the chambered cover glass. Incubate the cover glass. After incubation, remove the staining mixture from the chambers and wash each well with 300 microliters of sterile PBS.Replace the PBS with fresh media. Finally, proceed with visualization via confocal microscopy. Representative images of Burkholderia cepacia complex, or BCC clinical isolates, following 48 hours of growth in chambered cover glass with media alone or in the presence of 10%sputum filtrates demonstrate that their presence can change the architecture of the biofilm.The images were analyzed with Comstat software to obtain key biofilm parameters, including the average thickness of the biofilm, which was increased when treated with 10%sputum. In order to appreciate the different factors'effects on biofilm growth, clinical isolates were grown in media only or with sputum and either was treated with or without antibiotic. After watching this video, you should have a good understanding of how to form and treat biofilms on chambered cover glass and prepare them for staining and confocal analysis.

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