Name: high throughput, real-time, dual-readout testing of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity at JoVE.com

وأيد دراسة نشرت في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة R01AI099122 إلى JEK المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية لل الصحة. ونود أن نشكر جنيفر سميث، ديفيد روبل، سو تشيانغ، دوغ الفيضانات، شون جونستون، جنيفر Nale، ستيوارت Rudnicki، بول يان، ريتشارد سيو، وراشيل واردن من مرفق فحص ICCB-لونجوود و / أو مختبر الفحص الوطني ل للمراكز الإقليمية لنيو إنجلاند للتميز في الدفاع البيولوجي والأمراض المعدية (بدعم من U54AI057159) للمساعدة في التنمية وأداء المقايسات فحص عالية الإنتاجية الناشئة. كما نود أن نشكر كينيث سميث لتعليقات مفيدة على المخطوطة.

1. في الوقت الحقيقي بين الخلايا النمو وخلية حقيقية النواة السمسة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلايا المضيف (خلايا J774A.1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة J774A.1 المصحف العضلة الخلايا الشبيهة بلعم معلق في RPMI 1640 بن...

<ol>
	<li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus:+new+evidence+for+intracellular+persistence.">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li><li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression.">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li><li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics.">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li><li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+impermeant,+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format.">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li><li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires'+disease:+a+review.">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li><li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila.">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li><li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella:+macrolides+or+quinolones?.">Legionella: macrolides or quinolones?.</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li><li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5/Ipaf+signalling+pathways.">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein.">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li><li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Lorian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. , 330-396 (1996).</li><li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser.">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene.">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li><li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila.">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li><li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+Legionella+pneumophila.">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li><li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within.">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li><li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila.">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li><li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sid&#233;n, A., Pot&#225;cov&#225;, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+(Doxycycline,+Minocycline+and+COL-3)+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells.">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).</li><li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12.">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development.">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening.">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li><li>Dunlap, P., Thouand, G., Marks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. 1, 37-64 (2014).</li></ol>

وصفنا فحوصات في الوقت الحقيقي للكشف في وقت واحد من نمو البكتيريا داخل الخلايا والسمية لخلايا المضيف. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، لأداء فحص قوي، يجب أن يكون هناك ما يكفي من الفصل الطيفي بين قراءات البكتيرية والسمية الخلوية. هذا الفصل هو جوهري ل...

مسببات الأمراض التي تنمو أو يقيمون مؤقتا في حجرات داخل الخلايا صعبة للقضاء على علاجيا. إلزام أو إلزام نسبيا مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل البكتيريا المستروحة، الكوكسيلا البورنيتية، البروسيلا النيابة. ، الفرنسيسيلة التولارية، والمتفطرة النيابة. غالبا ما تتطلب دورات من العلاج المضادة للميكروبات لفترات طويلة للعلاج والتي قد تتراوح من أشهر إلى سنوات حتى. وعلاوة على ذلك، يمكن لمسببات الأمراض خارج الخلية تحتل عابر منافذ داخل الخلايا، وبهذه الطريقة الهروب إجازته الدورات العادية العلاج المضادة للميكروبات وتظهر في وقت لاحق لبدء جولات جديدة من العدوى الخبيثة. المكورات العنقودية الذهبية (1) وuropathogenic المعوية 2،3 الالتهابات مثالين المعترف بها على نحو متزايد. ولذلك، فإن الهدف الأساسي اكتشاف المخدرات هو تحديد مضادات الميكروبات الرواية التي تخترق المقصورات داخل الخلايا. العلاج الأمثل للقضاء بسرعةالكائنات الحية داخل الخلايا ومنع تطور المقاومة من خلال التعرض للميكروبات دون كابح أمر مرغوب فيه خاصة. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير تقنية فحص الإنتاجية العالية لتحديد مضادات الميكروبات، داخل الخلايا توغل تستهدف نمو الخلايا من مسببات المرض نموذج، البكتيريا المستروحة. وتشير 4 الملاحظات السريرية السابقة أن معيار اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات لم تتنبأ بدقة في الجسم الحي الكفاءة العلاجية ضد هذا الكائن الحي. 5 على وجه التحديد، وكان هذا بسبب فئات رئيسية من مضادات الميكروبات مثل β-اكتام وأمينوجليكوزيدات، على الرغم من فعالية عالية ضد نمت axenically البكتيريا، لا تخترق بدرجة كافية في حجرات داخل الخلايا حيث تتواجد البكتيريا. اقترح 5،6 الأدلة في وقت لاحق أن المقايسات نمو الخلايا فنيا أكثر تعقيدا توقعت فعال الفعالية السريرية. 7 </sup&gt; لسوء الحظ، كانت هذه المقايسات النهاية شاقة للغاية المقايسات، والتي تتطلب الضامة المصابة، وتعامل مع مضادات الميكروبات، أن هي lysed في أوقات مختلفة من النقاط لتشكيل مستعمرة حدة التعداد. هذه المقايسات ليست عملية للقيام على نطاق واسع وغير مناسبة لاكتشاف الأدوية الإنتاجية العالية. لذلك، قمنا بتطوير تكنولوجيا لتحديد الوقت الحقيقي لنمو البكتيريا داخل الخلايا. 6 وقد تحقق ذلك من خلال استخدام السلالة البكتيرية المعدلة من خلال دمج إما بكتيري وسيفيراز الاوبرون 8 (أول فحص جيل، وصفت سابقا) 4 أو الفلورسنت البروتين 9 صحفيين (الجيل الثاني، فحص متعامد، وصفت هنا) في كروموسوم البكتيريا. وبهذه الطريقة، الانارة أو إشارة الفلورسنت توفر بديل، في الوقت الحقيقي قراءات من عدد البكتيريا. ومع ذلك، هذه الصفات لا تعالج المحير رئيسيا في infectio داخل الخلاياالمقايسات ن، والآثار بعيدا عن الهدف في الخلايا المضيفة. على وجه الخصوص، وفاة الخلية المضيفة يحد بطبيعتها نمو الخلايا وتؤدي إلى تحديد هوية كاذبة من تأثير مضاد للميكروبات. كما العديد من المركبات في المكتبات الفحص هي أن الخلايا حقيقية النواة السامة، هذه ايجابيات كاذبة تطغى مضادات الجراثيم الحقيقية، مما يستلزم عددا كبيرا من المتابعة، المقايسات نقطة النهاية السمية الخلوية للقرار. وبالتالي، كان من اهتمام كبير لتكون قادرة على تقييم بقاء الخلية حقيقية النواة ونمو الخلايا في وقت واحد. والجدير بالذكر، سمة من سمات الخلايا حقيقية النواة غير قابلة للحياة هي فقدان النزاهة غشاء الخلية. ولذا قد تحقيقات أن اختبار نفاذية غشاء الخلية أن تستخدم لتقييم قابلية الخلية. وتتميز نحن سابقا قدرة سلسلة من خلية مزعومة غشاء impermeant، فلوري، والأصباغ الحمض النووي ملزم للوصول إلى وصمة عار الحامض النووي من الخلايا الميتة. (4) في الحمض النووي ملزم النووي، هذه الأصباغ عرض زيادة كبيرة في quantuم العائد الفلورسنت مما أدى إلى زيادة إشارة على حل الخلفية مضان. على هذا النحو، وفرت هذه الأصباغ قراءات كمية من موت الخلايا حقيقية النواة. 4 والجدير بالذكر أن وجدنا أن عددا منهم كان غير سامة أنفسهم خلال فترة طويلة شارك في الحضانة مع الضامة J774. عندما تضاف أثناء الإصابة الأولية، قدموا في الوقت الحقيقي، قراءات الفلورسنت من موت الخلايا حقيقية النواة التي يمكن أن يقاس على مقياس التألق صفيحة أو احظ مجهريا. لذلك، من خلال الجمع بين استخدام مراسل البكتيرية وغير سامة، غشاء impermeant، والأصباغ الحمض النووي ملزم، كنا قادرين على تطوير بسيط، غير مدمرة، في الوقت الحقيقي فحص لقياس كل الحمولة الجرثومية وحقيقية النواة السمية لخلايا في وقت واحد. وقد سمح هذا الاختبار لنا على الشاشة في 384 بئر شكل لوحة ~ 10،000 bioactives المعروفة بما في ذلك ~ 250 مضادات الميكروبات و&gt; 240،000 جزيئات صغيرة مع النشاط uncharacterized وظيفيا عن القدرة على كبح نمو الخلايا منالبكتيريا المستروحة، بينما في الوقت نفسه توليد بيانات الخلية سمية الخلايا حقيقية النواة لكل مجمع. وكان 6 تحليلنا لمضادات الميكروبات المعروفة ضد نمو الخلايا من البكتيريا استكشاف أشمل من هذا النوع حتى الآن. 6 وبناء على كفاءة التنسيق فحص لدينا، ونحن أيضا استكشاف في وقت لاحق من الآثار المحتملة المستمرة للمضادات الحيوية المعروفة عند استخدامها في الجمع. واحد من الاختبارات التآزر الأكثر شيوعا، ما يسمى فحص اللوحة، يتم تنفيذ standardly من خلال تقييم الآثار اندماجي من التخفيفات المسلسل شقين اثنين أو أكثر من مضادات الميكروبات. 10 وفي هذه المقايسات، ويعرف التآزر من خلال رصد تأثير أكبر عندما يتم تطبيق اثنين أو أكثر من مضادات الميكروبات معا من مجموع آثار كل تطبيق على حدة. وتجدر الإشارة، حتى الآن، ركز فقط وأجري اختبار التآزر انتقائية ضد الخلايا المستروحة البكتيريا </eم&gt; بسبب المجهود الكبير تشارك في المقايسات نقطة النهاية التقليدية مضروبا في التباديل اندماجي المطلوبة. لتسهيل اختبار التآزر، التي قطعناها على أنفسنا استخدام ما لدينا في الوقت الحقيقي نمو الخلايا / حقيقيات النوى فحص السمية الخلوية في تركيبة مع الآلية التكنولوجيا الاستغناء الرقمية (6). هذا أتمتة يسمح لنا الاستغناء التخفيفات المسلسل من المركبات الذائبة في DMSO أو محلول مائي منفردة أو مجتمعة في شكل 384 أيضا. 11 وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه قوية تكنولوجيا معالجة السائل يسمح لنا لأداء بسهولة دقة أعلى، مربع الجذر لطفلين (بدلا من المعيار، دقة أقل، ومضاعفة) مجموعات تخفيف لتحقيق مستويات أعلى من الدقة في منطقتنا ثنائي الأبعاد، الشطرنج التآزر تحليل. وكان هذا القرار قيمة خاصة في معالجة الشواغل في مجال التآزر حول استنساخ عند استخدام شقين التخفيف سلسلة 12. وأخيرا، كان لدينا فحص الكمي وأيضا ذرefore قياس التدرج من كبت. ونتيجة لذلك، استولت على فحص مجمل المعلومات المثبطة، التعبير عنه في isobolograms isocontour التي isocontours ربط تركيزات اندماجي مع مستويات مماثلة من تثبيط النمو. 6 سمحت هذه الاستراتيجية التآمر تصور اندماجي منحنيات الاستجابة للجرعة. لتوضيح منهجية لدينا، ونحن تصف بروتوكول لدينا لأداء هذه المقايسات وتظهر نتائج ممثلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1458">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">J774A.1 cells</td>
			<td style="width:248px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:161px;">TIB-67</td>
			<td style="width:627px;">Host cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">ACES</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9758&#160;</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Yeast extract, ultrafiltered</td>
			<td style="width:248px;">Becton-Dickinson/Difco</td>
			<td style="width:161px;">210929</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">K2000</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P5280</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P288-500</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C-7755</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ammonium iron(III) citrate</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F5879</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Potassium hydroxide solution, concentrated</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">SP236-500</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Deonized water</td>
			<td style="width:248px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Thymidine (tissue culture grade)</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">T1895</td>
			<td style="width:627px;">For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium &#8212; lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640, standard formulation</td>
			<td style="width:248px;">Corning via Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:627px;">For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">RPMI 1640 lacking phenol red</td>
			<td style="width:248px;">Corning via Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">17-105-CV</td>
			<td style="width:627px;">For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine &#8212; supplement to 2 mM before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)</td>
			<td style="width:248px;">HyClone via Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:627px;">For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Iron-supplemented calf serum</td>
			<td style="width:248px;">Gemini Bioproducts</td>
			<td style="width:161px;">100-510</td>
			<td style="width:627px;">For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trypan Blue solution</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">T8154</td>
			<td style="width:627px;">For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S7020</td>
			<td style="width:627px;">For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">GelRed, 10000X solution in water</td>
			<td style="width:248px;">Biotium</td>
			<td style="width:161px;">41003</td>
			<td style="width:627px;">For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red&#160; at 1X final concentration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">13-255-26</td>
			<td style="width:627px;">For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:248px;">BellCo Glass</td>
			<td style="width:161px;">7744-01010</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker flasks (250 ml)</td>
			<td style="width:248px;">ChemGlass Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">CLS-2038-04</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker clamps for flasks (250 ml)</td>
			<td style="width:248px;">BellCo Glass</td>
			<td style="width:161px;">7744-16250</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker flasks (1000 ml)</td>
			<td style="width:248px;">ChemGlass Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">CLS-2038-07</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker clamps for flasks (1000 ml)</td>
			<td style="width:248px;">BellCo Glass</td>
			<td style="width:161px;">7744-16100</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Sponge foam caps for flasks (250 ml - 1000 ml)</td>
			<td style="width:248px;">ChemGlass Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">CLS-1490-038</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">5840300</td>
			<td style="width:627px;">For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Combi standard bore manifold</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">24072670</td>
			<td style="width:627px;">Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling &#8212; increase to 80 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">White 384 well dishes treated for tissue culture</td>
			<td style="width:248px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">3570</td>
			<td style="width:627px;">For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D2650</td>
			<td style="width:627px;">For dissolving positive control and test compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Azithromycin</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">PHR1088</td>
			<td style="width:627px;">Antibiotic positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Saponin (from Quillaja bark)</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S-4521</td>
			<td style="width:627px;">Cytoxicity positive control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Multichannel pipettor</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Finnpipette</td>
			<td style="width:627px;">For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Epson pin transfer robot</td>
			<td style="width:248px;">Epson/ICCB-L</td>
			<td style="width:161px;">(Custom equipment)</td>
			<td style="width:627px;">For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">&#160;D300 digital dispensing system</td>
			<td style="width:248px;">Hewlett-Packard via Tecan</td>
			<td style="width:161px;">D300</td>
			<td style="width:627px;">For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">T8+ cartridges for D300 digital dispensing system</td>
			<td style="width:248px;">Hewlett-Packard via Tecan</td>
			<td style="width:161px;">T8+</td>
			<td style="width:627px;">For dispensing test compounds</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:423px;">EnVision multi-mode plate reader</td>
			<td style="width:248px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:161px;">(Contact manufacturer)</td>
			<td style="width:627px;">For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and &#8220;high concentration mode. For luminescence detection, use the &#34;USLUM&#34; protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera</td>
			<td style="width:248px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Ti</td>
			<td style="width:627px;">For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Glass-bottom tissue culture dishes</td>
			<td style="width:248px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:161px;">P35G-1.5-20-C</td>
			<td style="width:627px;">For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.&#160; These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Photoshop CS6</td>
			<td style="width:248px;">Adobe</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:627px;">Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Mathematica 10</td>
			<td style="width:248px;">Wolfam</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:627px;">For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, real-time, dual-readout testing of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity

تعتمد المعايير التقليدية للنشاط مضادات الميكروبات داخل الخلايا والسمية لخلايا حقيقية النواة على المقايسات نقطة النهاية. وتتطلب هذه المقايسات نقطة النهاية العديد من الخطوات التجريبية الإضافية قبل قراءات، مثل تحلل الخلية، مستعمرة تشكيل وحدة المصير، أو إضافة كاشف. عند تنفيذ الآلاف من المقايسات، على سبيل المثال، أثناء فحص عالية الإنتاجية، وجهد المصب المطلوبة لهذه الأنواع من المقايسات لا بأس بها. لذلك، لتسهيل عالية الإنتاجية اكتشاف مضادات الميكروبات، قمنا بتطوير فحص في الوقت الحقيقي لتحديد وقت واحد مثبطات نمو البكتيريا داخل الخلايا وتقييم السمية لخلايا حقيقية النواة. على وجه التحديد، وتمكين الوقت الحقيقي للكشف عن نمو البكتيريا داخل الخلايا عن طريق وضع علامة السلالات البكتيرية فحص إما مع الاوبرون البكتيرية لوكس (1 شارع الجيل فحص) أو صحفيين ببروتين (2 الثانية جيل، فحص متعامد). وغير سامة، وخلية غشاء impermeant، النووي صبغ ملزم حمضوأضاف خلال العدوى الأولية الضامة. وتستبعد هذه الأصباغ من خلايا قابلة للحياة. ومع ذلك، تفقد الخلايا المضيفة غير قابلة للحياة سلامة الغشاء تسمح بدخول ووضع العلامات الفلورية من الحامض النووي (حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين). والجدير بالذكر أن الحمض النووي ملزمة يرتبط مع زيادة كبيرة في العائد الكم الفلورسنت التي توفر قراءات الحل القائم على وفاة الخلية المضيفة. وقد استخدمنا هذا الاختبار المشترك لأداء شاشة عالية الإنتاجية في شكل صفيحة، وتقييم نمو الخلايا والسمية الخلوية بواسطة المجهر. والجدير بالذكر، أن مضادات الميكروبات تظهر التآزر التي التأثير المشترك لاثنين أو أكثر من مضادات الجراثيم عند تطبيقها معا أكبر مما كانت عليه عندما تطبق بشكل منفصل. اختبار لفي المختبر التآزر ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا عادة مهمة هائلة كما يجب تقييم التباديل اندماجي من المضادات الحيوية بتركيزات مختلفة. ومع ذلك، وجدنا أن لدينا فحص في الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع الآلي، والاستغناء عن التكنولوجيا الرقمية صermitted اختبار التآزر سطحي. باستخدام هذه الأساليب، كنا قادرين على مسح منهجي عمل لعدد كبير من مضادات الجراثيم وحده، والجمع ضد مسببات المرض داخل الخلايا، البكتيريا المستروحة.

صفيحة فحص نمو الخلايا البيانية الشكل 1 الخطوات الفحص. الخطوات الآلي يظهر لا يمكن أن يؤديها يدويا. ومع ذلك، ومما يسهل الإنتاجية إلى حد كبير باستخدام أنظمة مناولة السائل. <p class="jove_content" ...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity at JoVE.com

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The overall goal of this protocol is to use a single combination real-time assay to identify specific small molecule inhibitors of intracellular bacterial growth that are non-toxic to host cells. This method can help answer key questions in the antimicrobial discovery field. Specifically, what types of compounds can penetrate into intracellular compartments and kill pathogens without harming the host cell?The main advantages of this technique are the bacterial growth mammalian cell toxicity are detected simultaneously using non-destructive, real-time assays. Generally, individuals new to this method will struggle with the scalability that it affords. Assaying greater than ten thousand compounds in a session requires a whole new set of techniques and equipment.In addition to Lucius, demonstrating a communal commitment to academic antimicrobial discovery and translational diagnostic microbiology are post-doctoral fellows, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn, and undergraduate Kat Truelson. To prepare host cells, culture J774A. 1 macrophage is in suspension in RPMI 1640, with nine percent iron supplemented calf serum.Initially passage cells in tissue culture flasks. After cells have become confluent in a 75 square centimeter tissue culture flask in 15 milliliters of medium, split the cells by scraping and diluting them to 65 milliliters with the same type of medium. Return 15 milliliters to the tissue culture flask, and transfer 50 milliliters to a 250 milliliter bacterial shaker flask.Aerate by setting rotation speed at approximately 120 revolutions per minute. For consistent growth, incubate at exactly five percent carbon dioxide and 37 degrees Celsius. Harvest the cells when they reach a density in the range of two point five million cells per milliliter, to five million cells per milliliter.Ensure dead cell percentage does not exceed 25 percent, as dead cells will increase background noise in cytotoxicity assays. It's critical to prevent cell settling in reservoirs when you're dispensing large volumes of macrophages and bacteria with liquid handlers. Swirl reservoirs every few minutes while dispensing to avoid non-uniformity and assay plate wells.Plate the cells in white tissue culture treated, 384 well microplates at 50, 000 cells in 30 microliters of tissue culture medium per well. Incubate microplates overnight to achieve ninety percent confluence on the day of the experiment. Prepare patches of bacteria for experiments, by spreading organisms thickly on a new BCYE plate and incubating one day to obtain confluent growth.Re-suspend the organisms in the same tissue culture medium used for the J774A. 1 cells. To perform the macrophage infection, add test compounds of interest, including screening compounds, and positive and negative controls for bacterial growth inhibition in eukaryotic cell lysis.Stock solutions should be dissolved at greater than or equal to 500x in DMSO or an aqueous solution, to allow sufficient dilution of the vehicle. Dilute luminescent bacteria to a target of two point five million CFU per millileter in tissue culture medium. Then, add appropriate non-toxic membrane impermeant nucleic acid finding dye at two point five x final assay concentration.Add 20 microliters of this mixture to each culture well. The final assay volume is 50 microliters and the final bacterial concentration should be one million CFU per milliliter for the lux epron reporter, or four million CFU per milliliter for the fluorescent protein reporter. Incubate at 37 degrees Celsius, for one to three days in five percent carbon dioxide at 100 percent relative humidity to prevent evaporative edge effects.To avoid temperature associated edge effects when reading assay results, thermally equilibrilate microplates prior to luminescence reading by placement in a single layer on a lab bench with lids ajar for approximately 20 minutes. Read bacterial growth and eukaryotic cell toxicity on a microplate luminometer and flourometer as appropriate for the reporters being used. Return microplates to the incubator if real-time readout at later time points is desired.Analyze the data as described in the text protocol. For dose response and synergy testing experiments, prepare macrophages in bacteria as before. Just prior to macrophage infection, or axenic incubation, use an automated liquid handling system to facilitate single dose response in combinatorial synergy testing set up through direct automated addition of antimicrobial dilutions according to manufacturers protocol.Add antimicrobials of experimental interest in a serial doubling dilution series. The goal is to span, on the high end, a concentration that completely eliminates growth, and on the low end, a concentration that shows no obvious activity. Shown here, are representative results over time for bacterial luminescence and cytotoxicity associated fluorescence.Note the contrasting effects of antimicrobial treatment and eukaryotic cell cytotoxic detergent. Dual IC50 and CC50 dose response determination in the same screening wells was used to determine selectivity for the antibiotic Doxycycline. Bacterial replication was inhibited by intermediate concentrations of antibiotic.However, cytotoxicity was observed at high concentrations consistent with the selectivity of approximately 100. The same assay format was used to test two dimensional dose response for combinations of Minocycline and Azithromycin. Isocontours connect points of equal intracellular growth inhibition.Here, concave isocontours suggested strong synergistic effects for the two drugs. Digital dispensing robotics for assay setup real-time readout, and high-throughput format enabled combinatorial triple synergy testing. Here, observation of a distinctly concave surface suggests a high degree of synergistic effect for combinations of Minocycline, Azithromycin, and Rifampin against intracellular growth of legionella pheumophila.After watching this video, you should have a good understanding of how to combine either fluorescent or luminescent assay read-out with real-time, cytotoxicity testing in high-throughput assay format. Following this procedure, other methods like confocal microscope can be applied answer questions about biological event in the whole cell, which are also sited with their antimicrobe activity or whole cell cytotoxicity. Though we studied the effects on legionella replication, the same techniques can also be applied to other intracellular pathogens such as Brucella, and microbacteria.We first conceived to this protocol when trying to figure out an assay simple and reliable enough to use in a very high-throughput screening format. Don't forget that working with bacterial pathogens, cell lines, and robotic equipment has some inherent risks and appropriate precautions should be taken, such as use of appropriate personal protective equipment while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

تحديد كفاءة المثبط الكيميائي ضد نمو توكسوبلازما غوندي داخل الخلايا باستخدام قياس النمو القائم على لوسيفيراز

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...