Name: high throughput, real-time, dual-readout testing of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity at JoVE.com

Исследования сообщили в этой рукописи была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здоровья под номером награду R01AI099122 к JEK Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института Здоровье. Мы хотели бы поблагодарить Дженнифер Смит, Дэвид Wrobel, Су Чан, Даг Flood, Шон Джонстон, Дженнифер Nale, Стюарт Рудницкий, Пол Ян, Ричард С.Ю., и Рэйчел Стража из Screening фонда ICCB-Longwood и / или национальной лаборатории скрининга для Новой Англии региональных центров передового опыта в Biodefense и вновь возникающих инфекционных болезней (при поддержке U54AI057159) за их помощь в разработке и выполнении скрининговых исследований с высокой пропускной способностью. Мы также хотели бы поблагодарить Кеннет П. Смита за полезные замечания по рукописи.

1. в реальном масштабе времени внутриклеточный роста и эукариотической клетки цитотоксичности <ol><li> Подготовка клетки-хозяева (J774A.1 клетки) <ol><li> Культура J774A.1 Mus Musculus макрофагами , как клетки в суспензии в среде RPMI 1640 с 9% железа с добавкой сыворотки теленка. Первоначально канал в ку?...

<ol>
	<li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus:+new+evidence+for+intracellular+persistence.">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li><li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression.">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li><li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics.">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li><li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+impermeant,+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format.">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li><li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires'+disease:+a+review.">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li><li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila.">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li><li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella:+macrolides+or+quinolones?.">Legionella: macrolides or quinolones?.</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li><li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5/Ipaf+signalling+pathways.">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein.">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li><li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Lorian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+9.">Ch. 9.</a> Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. , 330-396 (1996).</li><li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser.">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene.">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li><li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila.">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li><li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+Legionella+pneumophila.">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li><li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within.">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li><li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila.">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li><li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila.">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li><li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sid&#233;n, A., Pot&#225;cov&#225;, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+(Doxycycline,+Minocycline+and+COL-3)+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells.">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).</li><li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12.">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development.">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening.">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li><li>Dunlap, P., Thouand, G., Marks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. 1, 37-64 (2014).</li></ol>

Мы описываем анализы в режиме реального времени для одновременного обнаружения внутриклеточного роста бактерий и клетки-хозяина цитотоксичности. Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, для надежного проведения анализа, должно быть достаточным, спектральное разделение ме...

Возбудители, которые растут или временно проживают в внутриклеточным трудно терапевтически искоренить. Облигатные или относительно облигатные внутриклеточные патогены , такие как легионелл, Coxiella burnetii, Brucella SPP. , Francisella tularensis и Mycobacterium SPP. часто требуют длительного курса антибактериальной терапии для лечения, которые могут варьироваться от нескольких месяцев до даже лет. Кроме того, внеклеточные патогены могут скоротечно занимают внутриклеточные ниши и таким образом избежать зазора обычными курсами антибактериальной терапии, а затем появляются, чтобы начать новые раунды вирулентных инфекции. Золотистый стафилококк 1 и уропатогенные Enterobacteriaceae 2,3 инфекции два все чаще признаются примеры. Таким образом, основной целью обнаружения наркотиков является выявление новых противомикробных препаратов, которые проникают во внутриклеточные отсеки. Оптимальная терапия быстро ликвидироватьвнутриклеточные микроорганизмы и предотвратить развитие резистентности через суб-ингибиторной антимикробного воздействия особенно желательно. С этой целью мы разработали технологию высокопроизводительного скрининга для выявления внутриклеточных-пенетранта противомикробные препараты , нацеленные на внутриклеточный рост модели патогена, легионелл. 4 Предыдущие клинические наблюдения указывают на то, что стандартное тестирование чувствительность к антибиотикам не точно предсказать , в естественных условиях терапевтической эффективности против этого организма. 5 В частности, это произошло потому , что основные классы противомикробных , таких как бета-лактамов и аминогликозидов, хотя они весьма эффективны против axenically выращенного Legionella, не в достаточной степени проникают в внутриклеточные отсеки , где Legionella проживает. 5,6 Впоследствии данные свидетельствуют о том, что технически более сложные анализы внутриклеточного роста эффективно предсказали клиническую эффективность. 7 </sup&gt; К сожалению, эти анализы были чрезвычайно трудоемкие анализы конечных точек, требующих зараженных макрофаги, противомикробные препараты, чтобы быть лизируют в разное время точек для колониеобразующих единицы перечисления. Такие анализы являются непрактичными делать в больших масштабах и непригодны для обнаружения наркотиков с высокой пропускной способностью. Таким образом, мы разработали технологию для определения в реальном времени внутриклеточного роста бактерий. 6 Это было достигнуто за счет использования бактериального штамма модифицированного путем интеграции либо бактериальной люциферазы оперон 8 (проба первого поколения, описанный ранее) 4 или флуоресцентный белок 9 репортеров (второго поколения, ортогональный анализе описано здесь) в бактериальную хромосому. Таким образом, люминесцентный или флуоресцентный сигнал обеспечивает заменяющим, в режиме реального времени отсчет бактериального числа. Тем не менее, эти атрибуты не затрагивают основную confounder внутриклеточного infectioп анализы, вне цели воздействия на клетки-хозяева. В частности, гибель клетки-хозяина по своей сути ограничивает внутриклеточный рост и приводит к ложной положительной идентификации антимикробного эффекта. Поскольку многие соединения в библиотеках скрининга являются эукариотической клетки токсические, такие ложные срабатывания будут подавлять истинные противомикробные средства, что требует большого количества наблюдения, конечная точка цитотоксичности для разрешения. Таким образом, это был большой интерес, чтобы быть в состоянии оценить жизнеспособность клеток эукариот и внутриклеточный рост одновременно. Следует отметить, что характеристика нежизнеспособных эукариотических клеток является потеря целостности клеточных мембран. Поэтому Зонды, которые проверяют проницаемость клеточной мембраны, могут быть использованы для оценки жизнеспособности клеток. Ранее мы охарактеризовали способность ряда предполагаемо клеточных мембран-impermeant, флуоресцентный, ДНК-связывающих красителей для доступа и окрашивает ядерную ДНК мертвых клеток. 4 При связывании ядерную ДНК, эти красители показывать значительное увеличение quantuм флуоресцентный выход приводит к увеличению сигнала над фоном раствора флуоресценции. Таким образом, эти красители при условии количественного считывания эукариотической клеточной гибели. 4 Следует отметить, что мы обнаружили , что некоторые были не токсичны сами по себе в течение длительного совместной инкубации с J774 макрофагами. При добавлении во время первичной инфекции, они обеспечили в режиме реального времени, флуоресцентный отсчет эукариотической клеточной смерти, которая может быть измерена с помощью микропланшет флуориметре или наблюдаемую микроскопически. Таким образом, путем объединения использование бактериального репортера и нетоксичного, мембранная-impermeant, ДНК-связывающие красители, мы смогли разработать простой, неразрушающий, в режиме реального времени анализа для измерения как бактериальной нагрузки и эукариотической клетки цитотоксичность одновременно. Этот анализ позволил нам экран в 384-луночного формата пластины ~ 10000 известных биоактивных включая ~ 250 антимикробные и&gt; 240000 малые молекулы с функционально неохарактеризованной активностью по способности ингибировать внутриклеточный ростЛегионелл, в то же время при создании эукариотических данных цитотоксичности для каждого соединения. 6 Наш анализ известных антимикробных против внутриклеточного роста легионелл был наиболее полное исследование этого типа на сегодняшний день. 6 На основе эффективности нашего формате анализа, мы также исследовали в дальнейшем потенциально синергетические эффекты известных антимикробных при использовании в комбинации. Одним из наиболее распространенных тестов синергии, так называемый шахматный анализ, Стандартно выполняется путем оценки комбинаторных эффектов двукратными серийными разведениями двух или более противомикробных препаратов. 10 В этих анализах, синергизм определяется наблюдением большего эффекта , когда два или более противомикробные препараты применяются вместе , чем сумма эффектов каждого применяемого отдельно. Следует отметить, что до сих пор, только целенаправленным и селективным тестирование синергии проводили против внутриклеточных легионелл </eм&gt; из-за больших усилий, участвующих в традиционных конечных точек анализов, умноженное на комбинаторных перестановок требуется. Для облегчения тестирования синергии, мы использовали наш реального времени внутриклеточного роста / эукариотической анализа на цитотоксичность в сочетании с автоматизированной цифровой технологией раздаточного 6. Это автоматизации позволило нам обойтись серийных разведений соединений, растворенных в диметилсульфоксиде или в отдельности или в комбинации в виде 384-водного раствора. 11 Кроме того, такая надежная технология жидкости обработка позволила нам легко выполнять более высокое разрешение, квадратного корня из двух (а не стандарт, более низкое разрешение, удвоение) комбинации разбавления для достижения более высоких уровней специфичности в нашем двумерная, в шахматном порядке синергии анализ. Это разрешение было особенно ценно в решении проблем в области синергии о воспроизводимости при использовании двукратном разбавлении серии 12. И, наконец, наш анализ был количественным, а также TherEfore измеряется градаций торможения. В результате, анализ захватили полноту ингибиторной информации, экспрессируемый в isocontour isobolograms, в котором isocontours соединить комбинаторные концентрации с аналогичными уровнями ингибирования роста. 6 Эта стратегия позволила визуализировать построение комбинаторных кривых доза-ответ. Чтобы проиллюстрировать нашу методологию, мы описываем наш протокол для выполнения этих анализов и показывают репрезентативные результаты.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1458">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">J774A.1 cells</td>
			<td style="width:248px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:161px;">TIB-67</td>
			<td style="width:627px;">Host cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">ACES</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9758&#160;</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Yeast extract, ultrafiltered</td>
			<td style="width:248px;">Becton-Dickinson/Difco</td>
			<td style="width:161px;">210929</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">K2000</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P5280</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Potassium phosphate, dibasic</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P288-500</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C-7755</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ammonium iron(III) citrate</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F5879</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Potassium hydroxide solution, concentrated</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">SP236-500</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Deonized water</td>
			<td style="width:248px;">N/A</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td style="width:627px;">For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Thymidine (tissue culture grade)</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">T1895</td>
			<td style="width:627px;">For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium &#8212; lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640, standard formulation</td>
			<td style="width:248px;">Corning via Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:627px;">For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">RPMI 1640 lacking phenol red</td>
			<td style="width:248px;">Corning via Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">17-105-CV</td>
			<td style="width:627px;">For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine &#8212; supplement to 2 mM before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)</td>
			<td style="width:248px;">HyClone via Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:627px;">For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Iron-supplemented calf serum</td>
			<td style="width:248px;">Gemini Bioproducts</td>
			<td style="width:161px;">100-510</td>
			<td style="width:627px;">For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trypan Blue solution</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">T8154</td>
			<td style="width:627px;">For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">S7020</td>
			<td style="width:627px;">For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">GelRed, 10000X solution in water</td>
			<td style="width:248px;">Biotium</td>
			<td style="width:161px;">41003</td>
			<td style="width:627px;">For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red&#160; at 1X final concentration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">13-255-26</td>
			<td style="width:627px;">For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:248px;">BellCo Glass</td>
			<td style="width:161px;">7744-01010</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker flasks (250 ml)</td>
			<td style="width:248px;">ChemGlass Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">CLS-2038-04</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker clamps for flasks (250 ml)</td>
			<td style="width:248px;">BellCo Glass</td>
			<td style="width:161px;">7744-16250</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker flasks (1000 ml)</td>
			<td style="width:248px;">ChemGlass Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">CLS-2038-07</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Shaker clamps for flasks (1000 ml)</td>
			<td style="width:248px;">BellCo Glass</td>
			<td style="width:161px;">7744-16100</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Sponge foam caps for flasks (250 ml - 1000 ml)</td>
			<td style="width:248px;">ChemGlass Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">CLS-1490-038</td>
			<td style="width:627px;">For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">5840300</td>
			<td style="width:627px;">For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Combi standard bore manifold</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">24072670</td>
			<td style="width:627px;">Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling &#8212; increase to 80 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">White 384 well dishes treated for tissue culture</td>
			<td style="width:248px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">3570</td>
			<td style="width:627px;">For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D2650</td>
			<td style="width:627px;">For dissolving positive control and test compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Azithromycin</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">PHR1088</td>
			<td style="width:627px;">Antibiotic positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Saponin (from Quillaja bark)</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S-4521</td>
			<td style="width:627px;">Cytoxicity positive control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Multichannel pipettor</td>
			<td style="width:248px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Finnpipette</td>
			<td style="width:627px;">For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Epson pin transfer robot</td>
			<td style="width:248px;">Epson/ICCB-L</td>
			<td style="width:161px;">(Custom equipment)</td>
			<td style="width:627px;">For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">&#160;D300 digital dispensing system</td>
			<td style="width:248px;">Hewlett-Packard via Tecan</td>
			<td style="width:161px;">D300</td>
			<td style="width:627px;">For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">T8+ cartridges for D300 digital dispensing system</td>
			<td style="width:248px;">Hewlett-Packard via Tecan</td>
			<td style="width:161px;">T8+</td>
			<td style="width:627px;">For dispensing test compounds</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:423px;">EnVision multi-mode plate reader</td>
			<td style="width:248px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:161px;">(Contact manufacturer)</td>
			<td style="width:627px;">For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and &#8220;high concentration mode. For luminescence detection, use the &#34;USLUM&#34; protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera</td>
			<td style="width:248px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Ti</td>
			<td style="width:627px;">For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Glass-bottom tissue culture dishes</td>
			<td style="width:248px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:161px;">P35G-1.5-20-C</td>
			<td style="width:627px;">For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.&#160; These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Photoshop CS6</td>
			<td style="width:248px;">Adobe</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:627px;">Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Mathematica 10</td>
			<td style="width:248px;">Wolfam</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:627px;">For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, real-time, dual-readout testing of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity

Традиционные меры внутриклеточного антимикробной активности и эукариотических клеток цитотоксичности полагаются на конечных анализов. Такие конечные точки анализы требуют несколько дополнительных экспериментальных шагов до начала считывания, такие как лизис клеток, определение элементарной колониеобразующих или добавления реагента. При выполнении тысячи анализов, например, во время высокопроизводительного скрининга, усилие вниз по течению, необходимое для этих типов анализов значительна. Поэтому, чтобы облегчить высокую пропускную способность противомикробное открытие, мы разработали анализ в режиме реального времени для одновременного идентификации ингибиторов внутриклеточного роста бактерий и оценки эукариотической клетки цитотоксичность. В частности, обнаружение внутриклеточный рост бактерий в режиме реального времени стало возможным благодаря маркировке бактериальных штаммов скрининга либо с бактериальным лк оперона (1 - е поколение) для анализа или флуоресцентный белок репортеров (2 - го поколения, ортогональным анализ). Нетоксичное, клеточная мембрана-impermeant, кислотно-связывающий краситель нуклеиновойТакже была добавлена ​​во время первичного инфицирования макрофагов. Эти красители исключаются из жизнеспособных клеток. Тем не менее, нежизнеспособные клетки-хозяева теряют целостность мембраны, разрешающий вход и флуоресцентного мечения ядерной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Следует отметить, что связывание с ДНК связано с большим увеличением флуоресцентного квантовым выходом, который обеспечивает считывание решение на основе гибели клетки-хозяина. Мы использовали этот комбинированный анализ для выполнения экран высокой пропускной способностью в формате микропланшетов, а также для оценки внутриклеточного роста и цитотоксичности с помощью микроскопии. Следует отметить, что противомикробные может демонстрировать синергизм в которых комбинированное действие двух или более антимикробных при применении вместе больше, чем при применении по отдельности. Тестирование на синергии в пробирке против внутриклеточных патогенов , как правило, чудовищный задача , как должна быть оценена комбинаторные перестановками антибиотиков при различных концентрациях. Тем не менее, мы обнаружили, что наши в режиме реального времени анализа в сочетании с автоматизированной, цифровой технологии раздаточного рermitted легкое тестирование синергии. Используя эти подходы, мы были в состоянии систематически обследовать действие большого числа одних антимикробных и в сочетании с внутриклеточным патогеном, легионелл.

Микропланшетов внутриклеточный анализ роста Рисунок 1 Схемы этапы анализа. Автоматизированные шаги, показанные могут быть выполнены вручную. Однако пропускная способность значительно облегчается с использованием жидких с?...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity at JoVE.com

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The overall goal of this protocol is to use a single combination real-time assay to identify specific small molecule inhibitors of intracellular bacterial growth that are non-toxic to host cells. This method can help answer key questions in the antimicrobial discovery field. Specifically, what types of compounds can penetrate into intracellular compartments and kill pathogens without harming the host cell?The main advantages of this technique are the bacterial growth mammalian cell toxicity are detected simultaneously using non-destructive, real-time assays. Generally, individuals new to this method will struggle with the scalability that it affords. Assaying greater than ten thousand compounds in a session requires a whole new set of techniques and equipment.In addition to Lucius, demonstrating a communal commitment to academic antimicrobial discovery and translational diagnostic microbiology are post-doctoral fellows, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn, and undergraduate Kat Truelson. To prepare host cells, culture J774A. 1 macrophage is in suspension in RPMI 1640, with nine percent iron supplemented calf serum.Initially passage cells in tissue culture flasks. After cells have become confluent in a 75 square centimeter tissue culture flask in 15 milliliters of medium, split the cells by scraping and diluting them to 65 milliliters with the same type of medium. Return 15 milliliters to the tissue culture flask, and transfer 50 milliliters to a 250 milliliter bacterial shaker flask.Aerate by setting rotation speed at approximately 120 revolutions per minute. For consistent growth, incubate at exactly five percent carbon dioxide and 37 degrees Celsius. Harvest the cells when they reach a density in the range of two point five million cells per milliliter, to five million cells per milliliter.Ensure dead cell percentage does not exceed 25 percent, as dead cells will increase background noise in cytotoxicity assays. It's critical to prevent cell settling in reservoirs when you're dispensing large volumes of macrophages and bacteria with liquid handlers. Swirl reservoirs every few minutes while dispensing to avoid non-uniformity and assay plate wells.Plate the cells in white tissue culture treated, 384 well microplates at 50, 000 cells in 30 microliters of tissue culture medium per well. Incubate microplates overnight to achieve ninety percent confluence on the day of the experiment. Prepare patches of bacteria for experiments, by spreading organisms thickly on a new BCYE plate and incubating one day to obtain confluent growth.Re-suspend the organisms in the same tissue culture medium used for the J774A. 1 cells. To perform the macrophage infection, add test compounds of interest, including screening compounds, and positive and negative controls for bacterial growth inhibition in eukaryotic cell lysis.Stock solutions should be dissolved at greater than or equal to 500x in DMSO or an aqueous solution, to allow sufficient dilution of the vehicle. Dilute luminescent bacteria to a target of two point five million CFU per millileter in tissue culture medium. Then, add appropriate non-toxic membrane impermeant nucleic acid finding dye at two point five x final assay concentration.Add 20 microliters of this mixture to each culture well. The final assay volume is 50 microliters and the final bacterial concentration should be one million CFU per milliliter for the lux epron reporter, or four million CFU per milliliter for the fluorescent protein reporter. Incubate at 37 degrees Celsius, for one to three days in five percent carbon dioxide at 100 percent relative humidity to prevent evaporative edge effects.To avoid temperature associated edge effects when reading assay results, thermally equilibrilate microplates prior to luminescence reading by placement in a single layer on a lab bench with lids ajar for approximately 20 minutes. Read bacterial growth and eukaryotic cell toxicity on a microplate luminometer and flourometer as appropriate for the reporters being used. Return microplates to the incubator if real-time readout at later time points is desired.Analyze the data as described in the text protocol. For dose response and synergy testing experiments, prepare macrophages in bacteria as before. Just prior to macrophage infection, or axenic incubation, use an automated liquid handling system to facilitate single dose response in combinatorial synergy testing set up through direct automated addition of antimicrobial dilutions according to manufacturers protocol.Add antimicrobials of experimental interest in a serial doubling dilution series. The goal is to span, on the high end, a concentration that completely eliminates growth, and on the low end, a concentration that shows no obvious activity. Shown here, are representative results over time for bacterial luminescence and cytotoxicity associated fluorescence.Note the contrasting effects of antimicrobial treatment and eukaryotic cell cytotoxic detergent. Dual IC50 and CC50 dose response determination in the same screening wells was used to determine selectivity for the antibiotic Doxycycline. Bacterial replication was inhibited by intermediate concentrations of antibiotic.However, cytotoxicity was observed at high concentrations consistent with the selectivity of approximately 100. The same assay format was used to test two dimensional dose response for combinations of Minocycline and Azithromycin. Isocontours connect points of equal intracellular growth inhibition.Here, concave isocontours suggested strong synergistic effects for the two drugs. Digital dispensing robotics for assay setup real-time readout, and high-throughput format enabled combinatorial triple synergy testing. Here, observation of a distinctly concave surface suggests a high degree of synergistic effect for combinations of Minocycline, Azithromycin, and Rifampin against intracellular growth of legionella pheumophila.After watching this video, you should have a good understanding of how to combine either fluorescent or luminescent assay read-out with real-time, cytotoxicity testing in high-throughput assay format. Following this procedure, other methods like confocal microscope can be applied answer questions about biological event in the whole cell, which are also sited with their antimicrobe activity or whole cell cytotoxicity. Though we studied the effects on legionella replication, the same techniques can also be applied to other intracellular pathogens such as Brucella, and microbacteria.We first conceived to this protocol when trying to figure out an assay simple and reliable enough to use in a very high-throughput screening format. Don't forget that working with bacterial pathogens, cell lines, and robotic equipment has some inherent risks and appropriate precautions should be taken, such as use of appropriate personal protective equipment while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

В режиме реального времени Визуализация лейкотриена B 4 Опосредованного миграции клеток и BLT1 Взаимодействие с β-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

В режиме реального времени изображений эндотелиальных межклеточных соединений Во нейтрофилов Трансмиграция в физиологических Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Определение эффективности химического ингибитора против внутриклеточного токсоплазмы Gondii Рост С помощью Люциферазы основе анализ роста

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...