Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة السلامة معهد باستور وفقا لوزارة الزراعة الفرنسية وإرشادات الاتحاد الأوروبي. 1. إعداد 96-جيدا وحيدة الخلية الفرز لوحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج ما قبل ?...

<ol>
	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على معلومات شاملة التعبير الجيني على مستوى نسيلي. هنا، ونحن التحقيق الكبد لجنة القانون الدولي عدم التجانس المقصورة. بعد الفرز وحيدة الخلية من السكان لجنة القانون الدولي مختلف (على أساس علامات سطح مؤتمر العمل الدولي أعرب على نطاق واسع)...

على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم التحقيق على نحو متزايد الخلايا اللمفاوية الفطرية (الاستقصائية). وعلى الرغم من عدم وجود مستقبلات مستضد معين، وأنها تنتمي إلى سلالة اللمفاوية وتمثل حراس مهم لتوازن الأنسجة والالتهابات. وتنقسم الاستقصائية حاليا إلى ثلاث مجموعات على أساس التعبير عنها من مجموعات محددة عامل النسخ وعلى قدرتها على إنتاج السيتوكينات 6 و 7. تساهم الاستقصائية إلى العديد من حالات التماثل الساكن والفيزيولوجية المرضية في أجهزة متنوعة عبر إنتاج السيتوكينات محددة 8 و 9. لتكون قادرة على فهم دور هذه الخلايا، فمن المهم تحديد مختلف المجموعات السكانية الفرعية مؤتمر العمل الدولي في الجهاز وتحديد العلاقات التنموية. وبالإضافة إلى ذلك، تم المتعلقة ظواهر اللدونة بين مجموعات فرعية مختلفة. من خلال دراسة التباينمن الخلايا الموجودة في الجهاز واحد، فمن الممكن لتحديد مراحلها من النضج وللتمييز وظائفها المحددة. لتوضيح تقنية وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR، وقد تم اختيار الاستقصائية الكبدية، مع التركيز بشكل خاص على عدم التجانس في إطار المجموعة نفسها لجنة القانون الدولي (نوع 1 ILC) 10. أولا، من خلال استخدام التدفق الخلوي، وتميزت ثلاثة السكان لجنة القانون الدولي واضح في الكبد. تمثل مجموعة 1 مؤتمر العمل الدولي حوالي 80٪ من المستجيبات الفطرية، في حين أن اثنين من السكان الآخرين نادرة السكان لجنة القانون الدولي الكبدي (أقل من 5٪ من المستجيبات الفطرية). تم فرز هؤلاء السكان باستخدام أعرب على نطاق واسع علامات سطح الخلية من السكان لجنة القانون الدولي. ونتيجة لذلك، تم فرزها السكان لجنة القانون الدولي في الكبد تبدو واحدة مماثلة على نطاق واسع إلى آخر. وقد ظهرت وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR باعتبارها واحدة من أفضل التقنيات لتحقيق على وجه السرعة عدم تجانس هؤلاء السكان 11 </sتصل&gt;. يتم تحديد اثنين من الخصائص الرئيسية من خلال الاستفادة من وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR التقنية. أولا، من خلال النظر في مستوى نسيلي، فمن الممكن لاستعادة التعبير الجيني خلية محددة للمقارنة بين الخلايا التي تعرض على ما يبدو مراحل نمو مماثلة. ثم، من خلال النظر في مجموعة مختارة مسبقا من التعبير الجيني، وسوف نحدد التوقيعات وراثية جديدة استنادا إلى أنماط التعبير الجيني في وقت واحد في نقطة مرة واحدة. هذه الجوانب تسمح جمع مجموعة متنوعة واسعة من البيانات التعبير لعدد كبير من الخلايا، حتى على السكان نادر الحدوث حيث يتم تنفيذ هذه التقنية على مستوى نسيلي. وبالتالي، عدم التجانس لجنة القانون الدولي في الكبد ويمكن تقييم كاف. بعد ذلك، عن طريق فرز جميع الخلايا مع النمط الظاهري لجنة القانون الدولي العالمي، ويتم الحصول على نظرة واسعة للتعبير متعددة الجينات الكبد السكان لجنة القانون الدولي، على الرغم من أنها تمثل السكان نادرة للغاية. رقاقة القائم على ميكروفلويديك يسمح التجريب مع حتىكمية صغيرة من مادة الخلية. ونتيجة لذلك، فإن ملامح التعبير الجيني للسكان الخلية نادرة يمكن الحصول. استخدام الانترنت التوقيع الجيني برامج التحليل، مجموعات السكان الخلية والعلاقات المحتملة للخلايا يمكن التحقيق فيها. ونتيجة لذلك، الاختبارات الوظيفية لا يمكن أن يؤديها للتحقق من صحة البيانات التجميع على مستوى في الجسم الحي. يمكن تقييم عشرات من تعبيرات الجين الوقت نفسه على مئات أو أكثر من الخلايا واحدة على الشريحة نفسها 3 و 11 و 12. تصميم الاختبار هو أطول وأهم جزء من التجربة. تحديد الجينات ذات الصلة لفرضية لفحصها هو الهدف الأسمى للحصول على نتائج ذات الصلة. ثانيا، هناك حاجة إلى الرقابة الداخلية (مثل علامات سطح معروفة تستخدم لفرز) وضوابط محددة. هذا أمر بالغ الأهمية لاختبار خصوصية التمهيدي التضخيم، وكفاءة التضخيم، وركان غياب المنافسة التمهيدي. لذلك، والعمل مع وحيد الخلية متعدد RT-QPCR هو أسلوب للوقت، كما يتم تقييم التعبير متعددة الجينات في خلية في نفس الوقت. باستخدام نفس رقاقة ومزيج من المواد الكيميائية لجميع خلايا يحد من الأخطاء المحتملة من التلاعب ويسمح لاستنساخ بين العينات. وإجمالا، فإن جوانب مختلفة من وحيد الخلية متعدد RT-QPCR تسمح لإنتاج نتائج موثوق بها للغاية على مستوى نسيلي، مع مستوى كبير من الحساسية لمجموعة واسعة من العينات والجينات. النتائج التي تم الحصول عليها توفر بيانات قوية ومتينة للاختبارات الإحصاء الحيوية. ويمكن تحقيق ذلك بسبب الجانب ميكروفلويديك من طريقة، والذي يسمح للعمل على كميات صغيرة جدا من المواد ويؤدي إلى نتائج شاملة. وأخيرا، وذلك باستخدام البرمجيات عبر الإنترنت، فمن الممكن المقارنة بين السكان المطلوب.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

التعبير الجيني عدم التجانس هو ميزة مثيرة للاهتمام للتحقيق في السكان اللمفاوية. التعبير الجيني في هذه الخلايا تختلف خلال تنشيط الخلايا، والإجهاد، أو التحفيز. وحيدة الخلية التعبير الجيني تعدد الإرسال يمكن تقييم في وقت واحد من عشرات الجينات 1، 2، 3. على مستوى خلية واحدة، التعبير الجيني تعدد الإرسال يحدد التجانس السكاني 4، 5. انها تسمح للتمييز من عدم التجانس السكاني عن طريق تحديد كل من مزيج محتمل من مراحل السلائف متنوعة بين خلايا ناضجة وأيضا تنوع استجابات الخلايا للمحفزات. وقد وصفت الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) في الآونة الأخيرة كما يبلغ عدد سكانها المستجيبات الفطرية الاستجابة المناعية 6 و 7. في هذا البروتوكول، وعدم التجانس الخلية لمؤتمر العمل الدولي انهوالتحقيق في مقصورة patic خلال التوازن. حاليا، هذه التقنية الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم التعبير الجيني هو RT-QPCR. هذا التعبير الجيني التدابير الطريقة فقط جين واحد في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يمكن تقدير التباين في التعبير الجيني، وأن هناك حاجة إلى خلايا متعددة للاختبار واحد. وهذا يؤدي إلى قياس متوسط ​​التعبير الجيني للسكان. عند تقييم أعداد كبيرة من الجينات، يصبح RT-QPCR وقت-، reagent-، وطريقة تستغرق العينة. وبالتالي، فإن المفاضلة تحد من عدد الجينات أو السكان الخلية التي يمكن تقييمها، مما يزيد من خطر المفقودين الصورة العالمية. توضح هذه المخطوطة كيف حيدة الخلية متعدد RT-QPCR يمكن استخدامها للتغلب على هذه القيود. وقد استفادت هذه التقنية من على microfluidics مؤخرا التقدم التكنولوجي 1 و 2. ردود الفعل التي تحدث في متعدد رقائق RT-QPCR لا غير شاملالعيدين المستوى نانولتر. وبالتالي، التعبير الجيني وحيدة الخلية، وكذلك التعبير الجيني متعددة في وقت واحد، لا يمكن أن يؤديها في reagent-، sample-، وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. فمن الممكن لاختبار الجينات الخلوية توقيع التجانس على مستوى نسيلي بين مجموعات فرعية خلية ضمن مجموعة من السكان في مراحل النمو المختلفة أو في ظل ظروف مختلفة 4، 5. العمل على السكان نادر مع أعداد كبيرة من الشروط على مستوى خلية واحدة لم يعد قيدا.

السكان اللمفاوية عرض تنوع كبير في التعبير الجيني. في هذا البروتوكول، وكان التحقيق عدم التجانس الكبد مقصورة لجنة القانون الدولي باستخدام وحيدة الخلية متعدد التعبير الجيني RT-QPCR. وخلافا للتقنيات التعبير الجيني أخرى، وحيدة الخلية متعدد التعبير الجين?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات على مستوى نسيلي. وحيدة الخلية RT-QPCR يؤدي إلى نتائج موثوق بها للغاية مع حساسية قوية لمئات العينات والجينات.

وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...