Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Alle eksperimenter dyr blev godkendt af af Institute Safety Udvalget for Pasteur i overensstemmelse med det franske landbrugsministerium og EU-retningslinjerne. 1. Forbered en 96-brønds Single-celle Sortering Plate <ol><li> Forbered pre-amplifikation mix i et 1,5 ml rør ved tilsætning af 5,0 pi specifik retro-transkription puffer, 1,3 pi lav ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) TE-buffer (10 mM TE, pH 8, og 0,1 mM EDTA-opløsning; 0,2 uM filtreret ), og 0,2 pi Taq DNA polymerase per brønd (figur 1a)...

<ol>
	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

Denne protokol beskriver, hvordan man få udtømmende genekspression information på klonale niveau. Her undersøgte vi lever ILC rum heterogenitet. Efter encellede sortering af forskellige ILC populationer (baseret på bredt udtrykte ILC overflademarkører) blev prøver præ-forstærket til specifikke forhåndsudvalgte gener. Derefter blev den opnåede cDNA og primere påsat en multipleks RT-qPCR mikrofluid chip. Endelig opnåede vi ekspressionen af ​​48 forskellige gener fra 48 enkeltceller. Genekspression resulta...

I løbet af de sidste par år, har medfødte lymfoide celler (ILCs) i stigende grad blevet undersøgt. På trods af deres manglende antigen-specifikke receptorer, de tilhører den lymfoide afstamning og udgør vigtige Skildvagter for vævshomeostase og inflammation. ILCs øjeblikket opdelt i tre grupper baseret på deres ekspression af transkriptionsfaktor kombinationer og deres evne til at producere cytokiner 6, 7. ILCs bidrager til en lang række homeostatiske og patofysiologiske situationer i forskellige organer via specifik cytokinproduktion 8, 9. For at kunne forstå betydningen af ​​disse celler, er det vigtigt at bestemme de forskellige ILC subpopulationer pr orgel og at identificere deres udviklingsmæssige forhold. Derudover har fænomener af plasticitet mellem de forskellige undersæt været relateret. Ved at studere heterogenitetaf cellerne til stede i et organ, er det muligt at afgrænse deres stadium af modning og til at skelne deres specifikke funktioner. For at illustrere teknikken med single-celle multipleks RT-qPCR blev hepatiske ILCs udvalgt, med særlig vægt på deres heterogenitet inden for samme ILC gruppe (type 1 ILC) 10. Først ved anvendelse af flowcytometri, blev tre distinkte ILC populationer kendetegnet i leveren. Gruppe 1 ILC udgør ca. 80% af de medfødte effektorer, mens de to andre populationer er sjældne hepatiske ILC populationer (mindre end 5% af de medfødte effektorer). Disse populationer blev sorteret ved hjælp bredt udtrykte celle-overflade markører for ILC befolkninger. Som et resultat, sorteret ILC populationer i leveren ser stort set ens ene til den anden. Single-celle multipleks RT-qPCR har vist sig som en af de bedste teknikker til straks at undersøge heterogenitet disse populationer 11 </sop&gt;. To vigtige egenskaber bestemmes ved at drage fordel af en enkelt celle multipleks RT-qPCR teknik. Først ved at kigge på den klonale niveau, er det muligt at genvinde cellespecifik genekspression til sammenligning mellem celler, der tilsyneladende udviser lignende udviklingsstadier. Derefter, ved at se på en forud valgt kombination af genekspression, vil vi bestemme nye gen signaturer baseret på samtidige genekspressionsmønstre på én gang punkt. Disse aspekter tillader samling af en lang række ekspressionssystemer data for et stort antal celler, selv om sjældne populationer, eftersom teknikken udføres ved den klonale niveau. Derved kan ILC heterogenitet i leveren være tilstrækkeligt vurderet. Dernæst ved at sortere alle celler med en global ILC fænotype, er en bred oversigt over den multiple-genekspression af leveren ILC befolkninger opnået, selvom de repræsenterer ekstremt sjældne befolkninger. Mikrofluidapparat-baserede chip muliggør eksperimenter med endnuen lille mængde cellemateriale. Som følge heraf kan der opnås genekspressionsprofilerne af sjældne cellepopulationer. Brug online gen signatur analyse software, celle population klynger og potentielle celle relationer kan undersøges. Derfor kan funktionelle tests udføres for at validere clustering data på in vivo-niveau. Snesevis af genekspressioner kunne vurderes samtidig på flere hundrede eller flere enkelte celler på den samme chip 3, 11, 12. Design af assayet er den længste og vigtigste del af eksperimentet. Bestemmelsen af ​​de gener, der er relevante for den hypotese der skal testes er altafgørende for at opnå relevante resultater. For det andet er der behov for intern kontrol (såsom kendte overflademarkører anvendes til sortering) og specifik kontrol. Dette er afgørende for at teste primeramplifikation specificitet, effektivitet amplifikationen, og than fravær af primer konkurrence. Derfor arbejder med encellede multipleks RT-qPCR er en tidsbesparende teknik, som multiple-genekspression af en celle vurderes samtidig. Brug den samme chip og blanding af reagenser til alle celler begrænser de mulige fejl manipulation og giver mulighed for reproducerbarhed mellem prøverne. Helt, de forskellige aspekter af encellede multipleks RT-qPCR muliggør fremstillingen af ​​højt pålidelige resultater på den klonale niveau, med en stor grad af følsomhed for en bred vifte af prøver og gener. De opnåede resultater giver kraftfulde og robuste data for biostatistiske tests. Dette kan opnås på grund af den mikrofluid aspekt af fremgangsmåden, som giver mulighed for arbejde på meget små mængder af materiale og fører til udtømmende resultater. Endelig hjælp af online software, er det muligt at sammenligne de ønskede populationer.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Genekspression heterogenitet er en interessant funktion til at undersøge i lymfoide populationer. Genekspression i disse celler varierer under celleaktivering, stress eller stimulation. Encellede multiplex genekspression muliggør samtidig vurdering af snesevis af gener 1, 2, 3. På det encellede niveau, multiplex genekspression bestemmer befolkning heterogenitet 4, 5. Det giver mulighed for sondringen af ​​befolkningen heterogenitet ved at bestemme både den sandsynlige mix af forskellige prækursorer stadier blandt modne celler og også de mange forskellige celle responser på stimuli. Medfødte lymfoide celler (ILC) er for nylig blevet beskrevet som en population af medfødte effektorer af immunresponset 6, 7. I denne protokol, celle heterogenitet ILC hanpatic rum er undersøgt i homøostase. I øjeblikket er den mest anvendte teknik til at vurdere genekspression er RT-qPCR. Denne metode foranstaltninger genekspression kun ét gen ad gangen. Derudover kan denne metode ikke estimere heterogenitet af genekspression, da der er behov for flere celler til én test. Dette fører til målingen af ​​den gennemsnitlige genekspression af befolkningen. Ved vurdering stort antal gener, RT-qPCR bliver en tids-, reagent-, og prøve-forbrugende metode. Derfor afvejninger begrænse antallet af gener eller cellepopulationer, der kan evalueres, hvilket øger risikoen for manglende det globale billede. Dette håndskrift beskriver, hvordan encellede multipleks RT-qPCR kan anvendes til at overvinde disse begrænsninger. Denne teknik har nydt godt af de seneste mikrostrømning teknologiske fremskridt 1, 2. Reaktioner, der opstår i multiplex RT-qPCR chips ikke excBehov for nanoliter-niveau. Derfor encellede genekspression, såvel som samtidig multipel genekspression, kan udføres i en reagent-, prøvetagningsmo og omkostningseffektiv måde. Det er muligt at teste celle gen signatur heterogenitet på den klonale niveau mellem celledelmængder i en population på forskellige udviklingsstadier eller under forskellige betingelser 4, 5. Arbejde på sjældne populationer med et stort antal forholdene på enkeltcelle-niveau ikke længere en begrænsning.

Lymfoide populationer vise stor mangfoldighed i genekspression. I denne protokol, blev leveren ILC rum heterogenitet undersøgt ved hjælp af enkelt-celle multipleks RT-qPCR genekspression. I modsætning til andre genekspression teknikker, encellede multipleks RT-qPCR genekspression muliggør arbejde på flere populationer, selv de sjældneste, samtidig. Denne specificitet, kombineret med en høj følsomhed på klonale niveau, giver mulighed for undersøgelse af forskelle i gen signature...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Denne protokol beskriver, hvordan man vurdere ekspression af et stort array af gener på den klonale niveau. Single-celle RT-qPCR producerer meget pålidelige resultater med en stærk følsomhed for hundreder af prøver og gener.

Single-celle genekspression Brug Multiplex RT-qPCR at Karakterisere Meget forskellige sjældne Lymfoide populationer

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser af Cirkulerende miRNA i irritabel tyktarm Opdagede Ved hjælp af en Multiplexed Højkapacitetsforskning Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studie af Cyklusreguleret Gen Expression af To Komplementære Celle Synkronisering Protokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Måling af genekspression i bombarderede Byg Aleurone lag med øget gennemløb

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode til at styre og analysere gen Expression mønstre i celle-til-celle interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Ved hjælp af musen oocyter at vurdere menneskelige genfunktion under meiose jeg

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...