Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Pasteur Instituut commissie Veiligheid in overeenstemming met het Franse Ministerie van Landbouw en de EU-richtlijnen. 1. Maak een 96-well Single-cell sorteren Plate <ol><li> Bereid voorversterking mix in een 1,5 ml buis door het toevoegen van 5,0 pi specifieke retro-transcriptie buffer, 1,3 pl lage ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) TE-buffer (10 mM TE, pH 8, en 0,1 mM EDTA oplossing, 0,2 uM gefiltreerd ) en 0,2 pi Taq DNA polymerase per putje (figuur 1a)...

<ol>
	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

Dit protocol beschrijft hoe uitputtend genexpressie informatie op het klonale niveau te verkrijgen. Hier, onderzochten we de lever ILC compartiment heterogeniteit. Na eencellige sorteren van de verschillende ILC populaties (gebaseerd op algemeen voor ILC oppervlak markers), monsters werden voorversterkte voor specifieke vooraf geselecteerde genen. Vervolgens worden de verkregen cDNA en primers werden op een multiplex RT-qPCR microfluïdische chip. Tenslotte kregen we de expressie van 48 genen van verschillende 48 indivi...

In de afgelopen jaren, aangeboren lymfoïde cellen (ILC) in toenemende mate onderzocht. Ondanks het ontbreken van antigeen-specifieke receptoren, zij behoren tot de lymfoïde afstamming en vormen belangrijke wachters voor weefsel homeostase en ontsteking. ILC&#39;s worden momenteel onderverdeeld in drie groepen op basis van hun expressie van specifieke transcriptiefactor en combinaties van hun vermogen om cytokinen 6, 7 produceren. ILC tot talrijke homeostatische en pathofysiologische situaties in diverse organen via specifieke cytokineproductie 8, 9. Om de rol van deze cellen te begrijpen, is het belangrijk om de verschillende subpopulaties ILC per orgaan bepalen en hun ontwikkeling relaties aan te geven. Bovendien zijn verschijnselen plasticiteit tussen de verschillende subgroepen gerelateerd. Door het bestuderen van de heterogeniteitvan de onderhavige in een orgaan cellen, is het mogelijk om het stadium van rijping te bepalen en hun specifieke functies te onderscheiden. Om de techniek van single-cell multiplex RT-qPCR te illustreren, werden de lever ILC gekozen, met een bijzondere nadruk op de heterogeniteit binnen dezelfde ILC groep (type 1 ILC) 10. Enerzijds door middel van flowcytometrie, werden drie verschillende populaties ILC kenmerk in de lever. Groep 1 ILC vertegenwoordigt ongeveer 80% van het aangeboren effectoren, terwijl de twee andere populaties zeldzame hepatische ILC populatie (minder dan 5% van het aangeboren effectoren). Die populaties werden gesorteerd met behulp van algemeen voor het celoppervlak markers van ILC populaties. Hierdoor gesorteerd ILC populaties in de lever kijken grote lijnen gelijk aan elkaar. Eencellige multiplex RT-qPCR heeft ontpopt als een van de beste technieken om onmiddellijk een onderzoek in de heterogeniteit van deze populaties 11 </sup&gt;. Twee belangrijke eigenschappen worden bepaald door gebruik te maken van de eencellige multiplex RT-qPCR techniek. Ten eerste, door naar de klonale niveau, is het mogelijk om cel-specifieke genexpressie herstellen gedurende vergelijking van cellen die blijkbaar vergelijkbaar ontwikkelingsstadia geven. Vervolgens, door naar een vooraf geselecteerde combinatie van genexpressie, zullen we nieuwe genen handtekeningen bepalen gebaseerd op de gelijktijdige genexpressie patronen op één tijdstip. Deze aspecten staat hem toe allerlei expressie gegevens voor een groot aantal cellen, zelfs op zeldzame populatie, omdat de techniek wordt uitgevoerd op klonale niveau. Daardoor kan ILC heterogeniteit in de lever voldoende beoordeeld. Vervolgens sorteert alle cellen met een globaal ILC fenotype, een breed overzicht van de meervoudige genexpressie van de lever ILC populaties wordt verkregen, hoewel ze vertegenwoordigen uiterst zeldzaam populaties. A-microfluïdische gebaseerde chip maakt het mogelijk experimenteren met nogeen kleine hoeveelheid celmateriaal. Bijgevolg kan de genexpressieprofielen van zeldzame celpopulaties worden verkregen. Met behulp van online gen handtekening analyse software, mobiele bevolking clusters en potentiële cel relaties kunnen worden onderzocht. Bijgevolg kunnen functionele tests worden uitgevoerd om de clustering gegevens op in vivo niveau valideren. Tientallen genexpressies kunnen gelijktijdig worden beoordeeld op honderden of meerdere elementaire cellen op dezelfde chip 3, 11, 12. Uitvoering van de test is het langste en belangrijkste deel van het experiment. De bepaling van de genen voor de hypothese relevant beproeven essentieel om relevante resultaten te verkrijgen. Ten tweede, interne controle (zoals bekend oppervlaktemerkers gebruikt voor sorteren) en specifieke controles nodig. Dit is belangrijk om de primer amplificatie specificiteit, de efficiëntie van de amplificatie en t testenHij afwezigheid van primer concurrentie. Daarom werken met eencellige multiplex RT-qPCR is een tijdbesparende techniek als meervoudige genexpressie van een cel wordt beoordeeld tegelijkertijd. Met dezelfde chip en mengeling van reagentia voor alle cellen beperkt de mogelijke fouten van manipulatie en maakt reproduceerbaarheid tussen monsters. Geheel, de verschillende aspecten van eencellige multiplex RT-qPCR maakt de productie van zeer betrouwbare resultaten op klonale niveau met een grote mate van gevoeligheid voor diverse monsters en genen. De behaalde resultaten bieden krachtige en betrouwbare gegevens voor biostatistical testen. Dit kan worden bereikt door de microfluïdische aspect van de methode, waarmee het werk aan zeer kleine hoeveelheden materiaal en leidt tot uitgebreide gegevens. Bovendien zullen, met online software, is het mogelijk om de gewenste populaties vergelijken.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Genexpressie heterogeniteit is een interessante functie om te onderzoeken in lymfoïde populaties. Genexpressie in deze cellen varieert gedurende celactivering, stress of stimulatie. Eencellige multiplex genexpressie gelijktijdige beoordeling van tientallen genen 1, 2, 3. Bij de single-cell niveau, multiplex genexpressie bepaalt bevolking heterogeniteit 4, 5. Het maakt het onderscheid van de bevolking door heterogeniteit om zowel de waarschijnlijke precursor mengsel van verschillende stadia bij rijpe cellen en ook de diversiteit van cel responsen op stimuli. Aangeboren lymfoïde cellen (ILC) zijn recent beschreven als een populatie van aangeboren effectoren van het immuunrespons 6, 7. In dit protocol, cel heterogeniteit van de ILC hijpatic compartiment is onderzocht tijdens homeostase. Momenteel is de meest gebruikte techniek om genexpressie te beoordelen is RT-qPCR. Deze methode maatregelen genexpressie slechts één gen per keer. Bovendien kan deze methode niet inschatten heterogeniteit van genexpressie, aangezien meerdere cellen zijn nodig voor één test. Dit leidt tot de meting van de gemiddelde genexpressie van de bevolking. Bij de beoordeling van een groot aantal genen, RT-qPCR wordt een tijd-, reagens- en-sample in beslag methode. Vandaar dat de trade-offs beperking van het aantal genen of celpopulaties die kunnen worden geëvalueerd, waardoor het risico van het missen van de globale beeld. Dit manuscript beschrijft hoe ééncellige multiplex RT-qPCR kan worden gebruikt om deze beperkingen te overwinnen. Deze techniek heeft geprofiteerd van de recente technologische vooruitgang microfluidics 1, 2. Reacties die zich in multiplex RT-qPCR chips niet exceed de nanoliter-niveau. Derhalve eencellige genexpressie, en gelijktijdige meervoudige genexpressie, kan worden uitgevoerd in een reagens-, bemonster- en kosteneffectieve manier. Het is mogelijk om cellen genen profiel heterogeniteit testen op klonale niveau tussen celsubsets binnen een populatie in verschillende ontwikkelingsstadia of onder verschillende omstandigheden 4, 5. Aan zeldzame populaties met een groot aantal omstandigheden op de single-cell niveau niet langer een beperking.

Lymfoïde populatie weer grote diversiteit in genexpressie. In dit protocol, werd de lever ILC compartiment heterogeniteit onderzocht met behulp van single-cell multiplex RT-qPCR genexpressie. In tegenstelling tot andere genexpressie technieken eencellige multiplex RT-qPCR genexpressie laat werken op verschillende populaties, zelfs de meest zeldzame, tegelijkertijd. Deze specificiteit in combinatie met een hoge gevoeligheid op klonale niveau maakt het onderzoek van verschillen in gen han...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...