Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Alle Tierversuche wurden vom Institut Pasteur Sicherheitsausschuss in Übereinstimmung mit dem Französisch Landwirtschaftsministerium und die EU-Richtlinien genehmigt. 1. Bereiten Sie eine 96-Well-Einzellige Sortierplatte <ol><li> Bereiten Vorverstärkung Mischung in einem 1,5-ml-Röhrchen durch Zugabe von 5,0 ul spezifischen Retrotranskriptionspuffer 1,3 &amp; mgr; l niedrigen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) TE-Puffer (10 mM TE-Lösung, pH 8, und 0,1 mM EDTA-Lösung, 0,2 &amp; mgr; M filtriert ) und 0,2...

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Dieses Protokoll beschreibt, wie erschöpfend Genexpression Informationen auf der klonalen Ebene zu erhalten. Hier untersuchten wir ILC Kompartiment Heterogenität Leber. Nach einer Einzelzellsortierung verschiedener ILC Populationen (basierend auf weit ILC Oberflächenmarker ausgedrückt) wurden die Proben für bestimmte vorgewählte Gene vorverstärkt. Dann wurden die erhaltenen cDNA-Primer und geladen auf ein Multiplex-RT-qPCR mikrofluidischen Chip. Schließlich erhalten wir die Expression von 48 verschiedenen Genen ...

In den letzten Jahren, angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden zunehmend untersucht. Trotz ihres Mangels an antigenspezifischen Rezeptoren, sie gehören zu der lymphoiden Abstammungslinie und stellen wichtige sentinels für Gewebe-Homöostase und Entzündung. ILCs werden derzeit in drei Gruppen unterteilt auf der Grundlage ihrer Expression spezifischer Transkriptionsfaktor - Kombinationen und auf ihrer Fähigkeit , Cytokine 7 6, zu erzeugen. ILCs tragen zu zahlreichen Homöostase und pathophysiologischen Situationen in den verschiedenen Organen über spezifische Zytokin - Produktion 8, 9. Um die Rolle dieser Zellen zu verstehen, ist es wichtig, die verschiedenen Subpopulationen ILC pro Organ zu bestimmen und deren Entwicklungsbeziehungen zu identifizieren. Zusätzlich wurden Phänomene der Plastizität zwischen den verschiedenen Untergruppen verwandt. Durch die Heterogenität des Studiumsder Zellen, die in einem Organ, ist es möglich, die Reifungsstufe zu begrenzen und ihre spezifischen Funktionen zu unterscheiden. Um die Technik der Single-Cell - Multiplex - RT-qPCR illustrieren, wurden Leber ILCs gewählt, mit einem besonderen Schwerpunkt auf ihre Heterogenität innerhalb der gleichen ILC Gruppe (Typ 1 ILC) 10. Zuerst wird durch die Verwendung von Durchflusszytometrie, drei verschiedene ILC-Populationen wurden in der Leber gekennzeichnet. Gruppe 1 ILC entspricht rund 80% der angeborenen Effektoren, während die beiden anderen Populationen sind selten Leber ILC Populationen (weniger als 5% der angeborenen Effektoren). Diese Populationen wurden unter Verwendung allgemein ausgedrückt Zelloberflächenmarker von ILC Populationen sortiert. Als Ergebnis sortiert ILC-Populationen in der Leber weitgehend ähnlich aussehen einem zum anderen. Einzellige Multiplex - RT-qPCR hat sich als eine der besten Techniken entstanden, umgehend die Heterogenität dieser Populationen 11 untersuchen </sup&gt;. Zwei Hauptmerkmale werden bestimmt, indem die Vorteile der Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR-Technik nehmen. Erstens, indem auf der klonalen Ebene sucht, ist es möglich, zellspezifischen Genexpression für einen Vergleich zwischen den Zellen, die offenbar zeigen ähnliche Entwicklungsstadien zu erholen. Dann wird durch bei einer vorgewählten Kombination von Genexpressions suchen, werden wir neue Gensignaturen basierend auf simultanen Genexpressionsmuster zu einem Zeitpunkt bestimmen. Diese Aspekte ermöglichen die Sammlung einer großen Vielzahl von Expressionsdaten für eine große Anzahl von Zellen, auch bei seltenen Populationen, da die Technik auf der klonalen Ebene durchgeführt wird. Dadurch werden kann ILC Heterogenität in der Leber ausreichend bewertet. Als nächstes wird durch alle Zellen mit einem globalen ILC Phänotyp Sortierung, eine breite Übersicht über die Mehr Genexpression der Leber ILC Populationen erhalten wird, auch wenn sie extrem selten Populationen repräsentieren. Ein Mikrofluidik-basierten Chip ermöglicht das Experimentieren mit selbsteine geringe Menge an Zellmaterial. Als Folge können die Genexpressionsprofile von seltenen Zellpopulationen erhalten werden. Mit Online-Gen-Signatur-Analyse-Software, Zellpopulation Cluster und mögliche Zell Beziehungen untersucht werden. Folglich können Funktionstests durchgeführt werden , um die Cluster - Daten auf der in - vivo - Ebene zu überprüfen. Zehn Genexpressionen werden könnten gleichzeitig auf Hunderte oder mehr einzelne Zellen auf dem gleichen Chip 3, 11, 12 bewertet. Design des Assays ist der längste und wichtigste Teil des Experiments. Die Bestimmung der Gene, die für die Hypothese getestet werden, ist von größter Bedeutung relevante Ergebnisse zu erhalten. Zweitens, die interne Kontrolle (wie bekannte Oberflächenmarker für das Sortieren verwendet) und spezifische Kontrollen erforderlich sind. Dies ist entscheidend, um die Primer-Amplifizierung Spezifität zu testen, die Effizienz der Amplifikation und ter ohne Primer Wettbewerb. Daher arbeitet mit Einzelzell Multiplex-RT-qPCR ist ein zeitsparendes Verfahren, das als Multiple-Genexpression einer Zelle zur gleichen Zeit beurteilt wird. Mit dem gleichen Chip und Mischung von Reagenzien für alle Zellen begrenzt die möglichen Fehler der Manipulation und ermöglicht die Reproduzierbarkeit zwischen den Proben. Insgesamt lassen sich die verschiedenen Aspekte der Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR zur Herstellung von hochzuverlässige Ergebnisse auf der klonalen Ebene mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit für eine Vielzahl von Proben und Genen. Die erzielten Ergebnisse bieten leistungsfähige und robuste Daten für biostatistischen Tests. Dies kann aufgrund der mikrofluidischen Aspekt des Verfahrens erreicht werden, was auf sehr geringe Mengen an Material für die Arbeit ermöglicht und führt zu erschöpfende Ergebnisse. Schließlich Online-Software verwenden, ist es möglich, die gewünschten Populationen zu vergleichen.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Die Genexpression Heterogenität ist ein interessantes Feature in lymphatischen Populationen zu untersuchen. Genexpression in diesen Zellen variiert während der Zellaktivierung, Stress oder Stimulation. Einzelzell - multiplex Genexpression ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung von zehn Gene 1, 2, 3. Auf der Ebene einzelner Zellen, Multiplex - Genexpression bestimmt Bevölkerung Heterogenität 4, 5. Es ermöglicht die Unterscheidung der Bevölkerungs Heterogenität durch sowohl die wahrscheinliche mix von unterschiedlichen Vorstufen unter reifen Zellen und auch die Vielfalt von Zellantworten auf Stimuli zu bestimmen. Angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden als eine Population der angeborenen Effektoren der Immunantwort 6, 7 kürzlich beschrieben. In diesem Protokoll Zell Heterogenität der ILC erPatic Fach wird während der Homöostase untersucht. Derzeit ist die am weitesten verbreitete Technik Genexpression zu bewerten ist RT-qPCR. Bei dieser Methode wird die Genexpression nur ein Gen zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus kann dieses Verfahren nicht Heterogenität der Genexpression abzuschätzen, da mehrere Zellen für einen Test benötigt werden. Dies führt zu der Messung des mittleren Genexpression der Bevölkerung. Wenn eine große Zahl von Genen, die Beurteilung, RT-qPCR wird ein zeit-, reagenzien und Probenaufwändige Methode. Daher begrenzen die Trade-offs, die Anzahl der Gene oder Zellpopulationen, die ausgewertet werden können, wodurch das Risiko von der globalen Bild fehlt. Diese Handschrift beschreibt, wie Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR verwendet werden können, um diese Beschränkungen zu überwinden. Diese Technik wurde von den letzten Mikrofluidik technologischen Fortschritt profitiert 1, 2. Reaktionen auftreten in Multiplex-RT-qPCR-Chips nicht EXCNano--Ebene eed. Daher können Einzelzell Genexpression sowie gleichzeitige multiple Genexpression in einer reagenziendurchgeführt werden, Proben- und kostengünstige Weise. Es ist möglich , Zellen Gen - Signatur Heterogenität an der klonalen Ebene zwischen den Zell - Untergruppen in einer Population in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter verschiedenen Bedingungen 4, 5 zu testen. Die Arbeit an seltenen Populationen mit einer großen Anzahl von Bedingungen auf der Ebene einzelner Zellen ist nicht mehr eine Einschränkung.

Lymphatische Populationen zeigen eine große Vielfalt in der Genexpression. In diesem Protokoll wurde ILC Kompartiment Leber Heterogenität untersucht unter Verwendung von Expressionseinzelzell-Multiplex-RT-qPCR-Gens. Im Gegensatz zu anderen Techniken Genexpression ermöglicht Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR Genexpression Arbeiten an mehreren Populationen, auch die seltensten, zugleich. Diese Spezifität, gekoppelt mit einer hohen Empfindlichkeit bei der klonalen Ebene, ermöglicht die Unt...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

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Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

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Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...