Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

सभी पशु प्रयोगों फ्रेंच कृषि मंत्रालय और यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार पाश्चर संस्थान सुरक्षा समिति द्वारा की अनुमोदित किया गया। 1. एक 96 अच्छी तरह से एकल सेल छंटनी थाली तैयार <ol><li> विशिष्ट ?...

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इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्रतिरूप स्तर पर संपूर्ण जीन अभिव्यक्ति जानकारी प्राप्त करने के लिए कैसे। यहाँ, हम जिगर आईएलसी डिब्बे विविधता की जांच की। अलग आईएलसी आबादी (व्यापक रूप से व्यक्त आईएलसी सतह मार्क...

पिछले कुछ वर्षों में, जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं (आईएलसीएस) तेजी से जांच की गई है। विशिष्ट प्रतिजन रिसेप्टर्स की कमी के बावजूद, वे लसीकावत् वंश के हैं और ऊतक homeostasis और सूजन के लिए महत्वपूर्ण प्रहरी प्रतिनिधित्व करते हैं। आईएलसीएस वर्तमान में तीन विशिष्ट प्रतिलेखन कारक संयोजनों की उनकी अभिव्यक्ति पर और उनके साइटोकिन्स 6, 7 उत्पादन करने की क्षमता के आधार पर समूहों में विभाजित हैं। आईएलसीएस विशिष्ट साइटोकाइन उत्पादन 8, 9 के माध्यम से विविध अंगों में कई होमियोस्टैटिक और pathophysiological स्थितियों के लिए योगदान करते हैं। इन कोशिकाओं की भूमिका को समझने में सक्षम हो, यह अंग प्रति विभिन्न आईएलसी उप-जनसंख्या निर्धारित करने के लिए और उनके विकास के रिश्तों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, विभिन्न सबसेट के बीच प्लास्टिसिटी की घटना से संबंधित कर दिया गया है। विविधता का अध्ययन करकेएक अंग में मौजूद कोशिकाओं की, यह परिपक्वता के अपने मंच परिसीमित करने के लिए और उनके विशिष्ट कार्यों भेद करने के लिए संभव है। एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR की तकनीक वर्णन, यकृत आईएलसीएस उनकी विविधता पर, एक ही चुने गए हैं आईएलसी समूह (1 प्रकार आईएलसी) 10 के भीतर एक विशेष जोर देने के साथ। सबसे पहले, प्रवाह cytometry के उपयोग के माध्यम से, तीन अलग आईएलसी आबादी जिगर में विशेषता थे। समूह 1 आईएलसी, जन्मजात प्रभावोत्पादक का लगभग 80% का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि दो अन्य आबादी दुर्लभ यकृत आईएलसी आबादी (जन्मजात प्रभावोत्पादक के कम से कम 5%) कर रहे हैं। उन आबादी आईएलसी आबादी के लिए व्यापक रूप से व्यक्त सेल सतह मार्कर का उपयोग कर हल किया गया। नतीजतन, हल जिगर में आईएलसी आबादी दूसरे के लिए मोटे तौर पर इसी तरह की एक देखो। एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR सबसे अच्छा तकनीकों में से एक के रूप में उभरा है तुरंत इन आबादी 11 की विविधता जांच करने के लिए </s&gt; अप। दो मुख्य विशेषताओं एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR तकनीक का लाभ लेने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। सबसे पहले, प्रतिरूप के स्तर को देखकर, यह संभव है कि कोशिकाओं जाहिरा तौर पर इसी तरह के विकास के चरणों प्रदर्शन के बीच तुलना के लिए सेल विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति ठीक करने के लिए है। फिर, जीन अभिव्यक्ति का एक पूर्व चयनित संयोजन को देखकर, हम नए जीन हस्ताक्षर एक समय बिंदु पर एक साथ जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर तय करेंगे। इन पहलुओं, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए अभिव्यक्ति डेटा की एक विस्तृत विविधता के संग्रह की अनुमति है, यहां तक ​​कि दुर्लभ आबादी पर के बाद से तकनीक प्रतिरूप स्तर पर किया जाता है। इस प्रकार, जिगर में आईएलसी विविधता पर्याप्त रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। अगले, एक वैश्विक आईएलसी phenotype के साथ सभी कोशिकाओं छँटाई द्वारा, जिगर आईएलसी आबादी के कई-जीन अभिव्यक्ति की एक विस्तृत अवलोकन प्राप्त की है, भले ही वे अत्यंत दुर्लभ आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक microfluidic आधारित चिप के साथ भी प्रयोग की अनुमति देता हैसेल सामग्री की एक छोटी राशि। एक परिणाम के रूप में, दुर्लभ सेल आबादी के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त किया जा सकता है। ऑनलाइन जीन हस्ताक्षर विश्लेषण सॉफ्टवेयर, सेल की आबादी समूहों और संभावित सेल संबंधों का उपयोग कर जांच की जा सकती है। नतीजतन, कार्यात्मक परीक्षण में विवो स्तर पर क्लस्टरिंग डेटा को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति के दसियों सैकड़ों या एक ही चिप 3, 11, 12 के बारे में अधिक एकल कक्षों पर समन्वित रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। परख का डिजाइन प्रयोग की सबसे लंबी और सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। परीक्षण किया जा करने के लिए प्रासंगिक परिकल्पना जीनों के निर्धारण प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है। दूसरे, और विशिष्ट नियंत्रण (जैसे छँटाई के लिए इस्तेमाल किया जाना जाता सतह मार्कर के रूप में) आंतरिक नियंत्रण की जरूरत है। इस किताब प्रवर्धन विशिष्टता, प्रवर्धन की क्षमता है, और टी परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैवह प्राइमर प्रतियोगिता का अभाव। इसलिए, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के साथ काम कर रहे एक timesaving तकनीक, के रूप में एक सेल के कई-जीन अभिव्यक्ति एक ही समय पर मूल्यांकन किया जाता है। सभी कोशिकाओं के लिए एक ही चिप और अभिकर्मकों के मिश्रण का उपयोग हेरफेर के संभावित त्रुटियों को सीमित करता है और नमूनों के बीच reproducibility के लिए अनुमति देता है। कुल मिलाकर, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के विभिन्न पहलुओं के नमूने और जीन की एक विस्तृत विविधता के लिए संवेदनशीलता का एक बड़ा स्तर के साथ, प्रतिरूप स्तर पर अत्यधिक विश्वसनीय परिणाम के उत्पादन के लिए अनुमति देता है। प्राप्त परिणामों biostatistical परीक्षण के लिए शक्तिशाली और मजबूत डेटा प्रदान करते हैं। इस विधि है, जो सामग्री की बहुत छोटी मात्रा पर काम करने के लिए अनुमति देता है और संपूर्ण परिणाम होता है की microfluidic पहलू के कारण प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, यह संभव वांछित आबादी की तुलना है।

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

जीन अभिव्यक्ति विविधता लसीकावत् आबादी में जांच करने के लिए एक दिलचस्प सुविधा है। इन कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति सेल सक्रियण, तनाव, या उत्तेजना के दौरान बदलता रहता है। एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति जीन 1, 2, 3 के दसियों के एक साथ मूल्यांकन सक्षम बनाता है। एकल कोशिका के स्तर पर, मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति आबादी विविधता 4, 5 को निर्धारित करता है। यह दोनों परिपक्व कोशिकाओं के बीच विविध अग्रदूत चरणों के संभावित मिश्रण और भी उत्तेजनाओं को सेल प्रतिक्रिया की विविधता का निर्धारण करके जनसंख्या विविधता के गौरव के लिए अनुमति देता है। जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं (आईएलसी) ने हाल ही प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6, 7 की सहज प्रभावोत्पादक की आबादी के रूप में वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, आईएलसी वह सेल विविधताPatic डिब्बे homeostasis के दौरान जांच की है। वर्तमान में, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए RT-qPCR है। इस विधि के उपायों जीन अभिव्यक्ति एक समय में केवल एक ही जीन। साथ ही, इस विधि जीन अभिव्यक्ति की विविधता अनुमान नहीं कर सकते, क्योंकि कई कोशिकाओं को एक परीक्षण के लिए आवश्यक हैं। इस आबादी की औसत जीन अभिव्यक्ति की माप की ओर जाता है। जब जीनों की बड़ी संख्या का आकलन करने, आर टी-qPCR एक समय, reagent-, और नमूना लेने वाली विधि बन जाता है। इसलिए, व्यापार-नापसंद, जीन या सेल आबादी है कि मूल्यांकन किया जा सकता की संख्या को सीमित वैश्विक तस्वीर लापता का खतरा बढ़ रही है। इस पांडुलिपि का वर्णन कैसे एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR इन सीमाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक को हाल ही में तकनीकी विकास microfluidics 1, 2 से लाभ हुआ है। मल्टीप्लेक्स RT-qPCR चिप्स में होने वाली प्रतिक्रियाओं exc नहीं हैnanoliter स्तर eed। इसलिए, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति, साथ ही एक साथ कई जीन अभिव्यक्ति, एक reagent- में, sample- किया जा सकता है, और लागत प्रभावी ढंग से। यह 5, विभिन्न विकासात्मक चरणों में या अलग अलग परिस्थितियों 4 के तहत आबादी के भीतर सेल सबसेट के बीच प्रतिरूप स्तर पर सेल जीन हस्ताक्षर विविधता का परीक्षण करने के लिए संभव है। एकल कोशिका के स्तर पर स्थिति की बड़ी संख्या के साथ दुर्लभ आबादी पर काम करना अब कोई प्रतिबंध नहीं है।

Lymphoid आबादी जीन अभिव्यक्ति में महान विविधता प्रदर्शित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, जिगर आईएलसी डिब्बे विविधता एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR जीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर जांच की गई। अन्य जीन अभि?...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्रतिरूप के स्तर पर जीनों का एक बड़ा सरणी की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए। एकल कोशिका RT-qPCR नमूने और जीनों के सैकड़ों के लिए एक मजबूत संवेदनशीलता के साथ अत्यधिक विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है।

एकल कोशिका जीन एक्सप्रेशन मल्टीप्लेक्स RT-qPCR का उपयोग दुर्लभ Lymphoid आबादी की विविधता विशेषताएँ

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में miRNAs परिसंचारी की perturbations एक मल्टिप्लेक्स उच्च throughput जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म का उपयोग कर पाया

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

नमूना तैयारी और Zebrafish से RNASeq आधारित जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

वृद्धि का प्रवाह के साथ बमबारी जौ Aleurone परतों में जीन अभिव्यक्ति मापने

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मानव जीन समारोह का आकलन करने के लिए माउस अंडाणुओं का प्रयोग I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

त्रुटि-सही डीएनए और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर दुर्लभ घटना का पता लगाने

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...