Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati del da parte del Comitato per la sicurezza dell&#39;Istituto Pasteur in conformità con l&#39;agricoltura Ministero francese e gli orientamenti UE. 1. Preparare un 96 pozzetti Ordinamento Piastra Single-cell <ol><li> Preparare mix pre-amplificazione in una provetta da 1,5 ml aggiungendo 5,0 ml di specifiche tampone retrotrascrizione, 1,3 ml di bassa dell&#39;acido etilendiamminotetraacetico tampone (EDTA) TE (10 soluzione mM TE, pH 8, e la soluzione 0,1 ...

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	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. 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Questo protocollo descrive come ottenere informazioni esaustive espressione genica a livello clonale. Qui, abbiamo studiato il fegato ILC eterogeneità vano. Dopo l&#39;ordinamento cella singola di diverse popolazioni ILC (sulla base di marcatori di superficie ILC ampiamente espresse), i campioni sono stati pre-amplificati per specifici geni pre-selezionati. Poi, il cDNA ottenuto e primer sono stati caricati su un multiplex RT-qPCR chip microfluidico. Infine, abbiamo ottenuto l&#39;espressione di 48 geni diversi dal 48 ...

Nel corso degli ultimi anni, le cellule linfoidi innate (ILCS) sono stati sempre più studiati. Nonostante la loro mancanza di recettori antigene-specifiche, essi appartengono al lignaggio linfoidi e rappresentano sentinelle importanti per l&#39;omeostasi dei tessuti e l&#39;infiammazione. ILCs sono attualmente divisi in tre gruppi in base alla loro espressione di specifiche combinazioni di fattori di trascrizione e sulla loro capacità di produrre citochine 6, 7. ILC contribuiscono a numerose situazioni omeostatici e fisiopatologici in diversi organi attraverso la produzione di citochine specifiche 8, 9. Per essere in grado di comprendere il ruolo di queste cellule, è importante determinare le varie sottopopolazioni ILC per organo e per identificare le loro relazioni evolutive. Inoltre, fenomeni di plasticità tra i diversi sottoinsiemi sono stati correlati. Studiando l&#39;eterogeneitàdelle cellule presenti in un organo, è possibile delimitare la loro fase di maturazione e distinguere le loro funzioni specifiche. Per illustrare la tecnica di multiplex cella singola RT-qPCR, ILC epatici sono stati scelti, con una particolare attenzione per la loro eterogeneità all&#39;interno dello stesso gruppo ILC (tipo 1 ILC) 10. Innanzitutto, attraverso l&#39;uso di citometria a flusso, tre popolazioni ILC distinti stati caratterizzati nel fegato. Gruppo 1 ILC rappresenta circa il 80% degli effettori innati, mentre le altre due popolazioni sono rari popolazioni ILC epatiche (meno del 5% degli effettori innati). Quelle popolazioni sono stati ordinati utilizzando marcatori superficie cellulare ampiamente espresse delle popolazioni ILC. Come risultato, scelti popolazioni ILC nel fegato guardano uno sostanzialmente simile ad un altro. Multiplex cella singola RT-qPCR è emerso come uno dei migliori tecniche per investigare prontamente l&#39;eterogeneità di queste popolazioni 11 </sup&gt;. Due caratteristiche principali sono determinate dalla sfruttando il multiplex cella singola tecnica di RT-qPCR. Innanzitutto, cercando a livello clonale, è possibile recuperare l&#39;espressione genica specifica delle cellule per il confronto tra le cellule che apparentemente mostrano stadi di sviluppo simili. Poi, cercando in una combinazione pre-selezionata di espressione genica, si determinerà nuove firme genetiche sulla base di modelli di espressione genica simultanee a un certo punto del tempo. Questi aspetti permettono la raccolta di una grande varietà di dati di espressione per un gran numero di cellule, anche in rare popolazioni, dato che la tecnica viene eseguita a livello clonale. In tal modo, l&#39;eterogeneità ILC nel fegato può essere adeguatamente valutata. Avanti, di classificare tutte le cellule con un fenotipo ILC globale, un&#39;ampia panoramica della espressione genica multiple del fegato popolazioni ILC si ottiene, anche se rappresentano popolazioni estremamente rari. Un chip microfluidica-based consente la sperimentazione con ancorauna piccola quantità di materiale cellulare. Di conseguenza, i profili di espressione genica di popolazioni di cellule rare possono essere ottenuti. Usando in linea gene firma software di analisi, i cluster di popolazione cellulare e potenziali relazioni di cellule può essere indagato. Di conseguenza, i test funzionali possono essere eseguiti per convalidare i dati di clustering al livello in vivo. Decine di espressione genica può essere stabilita contemporaneamente su centinaia o più celle singole sullo stesso chip 3, 11, 12. Progettazione del saggio è la parte più lunga e più importante di questo esperimento. La determinazione dei geni rilevanti per l&#39;ipotesi da testare è fondamentale per ottenere risultati rilevanti. In secondo luogo, sono necessari dei controlli interni (come marcatori di superficie noti utilizzati per l&#39;ordinamento) e controlli specifici. Ciò è fondamentale per testare la specificità di primer di amplificazione, l&#39;efficienza dell&#39;amplificazione, e tegli assenza di concorrenza primer. Pertanto, lavorando con multiplex cella singola RT-qPCR è una tecnica risparmiare tempo, come espressione multipla gene di una cella è valutata allo stesso tempo. Utilizzando lo stesso chip e miscelazione dei reagenti per tutte le celle limita i possibili errori di manipolazione e consente riproducibilità tra i campioni. Complessivamente, i diversi aspetti della multiplex singola cellula RT-qPCR consente la produzione di risultati altamente affidabili a livello clonale, con un grande livello di sensibilità per un&#39;ampia varietà di campioni e geni. I risultati ottenuti offrono dati potenti e affidabili per i test di biostatistica. Ciò può essere ottenuto grazie all&#39;aspetto microfluidica del metodo, che consente di lavorare su piccolissime quantità di materiale e porta a risultati esaustivi. Infine, utilizzando software online, è possibile confrontare le popolazioni desiderati.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Espressione genica eterogeneità è una caratteristica interessante per indagare nelle popolazioni linfoidi. Espressione genica in queste cellule varia durante l&#39;attivazione delle cellule, stress, o la stimolazione. Single-cell espressione genica multiplex consente la valutazione simultanea di decine di geni 1, 2, 3. A livello di singola cellula, l&#39;espressione genica multiplex determina popolazione eterogeneità 4, 5. Esso permette la distinzione di eterogeneità della popolazione per determinare sia la probabile mix di diversi stadi precursori tra cellule mature e anche la diversità delle risposte delle cellule agli stimoli. Cellule linfoidi innate (ILC) Recentemente sono state descritte come una popolazione di effettori innate della risposta immunitaria 6, 7. In questo protocollo, l&#39;eterogeneità delle cellule della ILC haVano Patic è indagato durante l&#39;omeostasi. Attualmente, la tecnica più utilizzata per valutare l&#39;espressione genica è RT-qPCR. Questo metodo misura l&#39;espressione genica solo un gene alla volta. Inoltre, questo metodo non può stimare eterogeneità di espressione genica, poiché più celle sono necessari per una prova. Questo porta alla misurazione dell&#39;espressione genica media della popolazione. Nel valutare un gran numero di geni, RT-qPCR diventa un tempo-, e il metodo di campionamento che consumano reagent-. Quindi, i compromessi limitano il numero di geni o popolazioni di cellule che possono essere valutati, aumentando il rischio di perdere il quadro globale. Questo manoscritto descrive come multiplex singola cellula RT-qPCR può essere utilizzato per superare queste limitazioni. Questa tecnica ha beneficiato di recente microfluidica progressi tecnologici 1, 2. Le reazioni che si verificano in multiplex chip RT-qPCR non lo fanno exceed il livello nanolitro. Quindi, l&#39;espressione genica cella singola, nonché simultanea espressione genica multipla, possono essere eseguite in un reagent-, di prova e conveniente modo. È possibile testare genica firma eterogeneità a livello clonale tra sottogruppi di cellule in una popolazione a diversi stadi di sviluppo o in diverse condizioni 4, 5. Lavorando in rare popolazioni con un gran numero di condizioni a livello di singola cellula non è più una limitazione.

popolazioni linfoidi grandi differenze in termini di espressione genica. In questo protocollo, fegato vano ILC eterogeneità è stata studiata usando multiplex cella singola RT-qPCR espressione genica. A differenza di altre tecniche di espressione genica, multiplex cella singola RT-qPCR espressione genica permette lavori su varie popolazioni, anche i più rari, allo stesso tempo. Questa specificità, accoppiato con un elevata sensibilità a livello clonale, permette la ricerca di differe...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Questo protocollo descrive come valutare l&#39;espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

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Ricerca

Genetica

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