Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
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This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

全ての動物実験は、フランス農業省とEUのガイドラインに従ってパスツール研究所安全委員会の承認されました。 1. 96ウェルシングルセルソーティングプレートを準備します<ol><li>特定のレトロ転写緩衝液5.0μlを、低エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、TE緩衝液（10mMのTE溶液を、pHが8、および0.1mM EDTA溶液の1.3μLを添加することによって、1.5mlチューブ中でプレ増幅ミックスを調製し、0.2μ...

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	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. 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このプロトコルは、クローンレベルでの網羅的な遺伝子発現情報を取得する方法について説明します。ここでは、肝臓ILCコンパートメントの不均一性を調べました。 （広く発現ILC表面マーカーに基づいて）異なるILC集団の単一細胞選別後、サンプルを特定の予め選択された遺伝子のための予備増幅しました。次に、得られたcDNAおよびプライマーは、多重RT-qPCRをマイクロ流体チップにロード?...

過去数年間、先天性リンパ系細胞（ILCS）は、ますます研究されてきました。抗原特異的受容体の欠如にもかかわらず、彼らはリンパ系統に属し、組織の恒常性や炎症のための重要な番兵を表します。 ILCSは、現在、特定の転写因子の組合せの発現におよびサイトカイン6,7を産生する能力に基づいて3つのグループに分けています。 ILCSは、特定のサイトカイン産生8、9を介して多様な器官における数多くの恒常性および病態生理学的状況に貢献しています。これらの細胞の役割を理解することができるためには、臓器ごとに様々なILC亜集団を決定し、それらの発達の関係を識別することが重要です。また、異なるサブセット間の可塑性の現象が関連しています。異質性を研究することによって1つの器官に存在する細胞では、成熟のその段階を区切るために、それらの特定の機能を区別することが可能です。 単一セルの多重RT-qPCRの技術を説明するために、肝ILCSは同じILCグループ（タイプ1 ILC）10内に、その異質性に特に重点を置いて、選択されました。まず、フローサイトメトリーを使用することによって、三つの異なるILC集団は、肝臓中で特徴づけました。他の二つの集団が、稀な肝ILC集団（先天性エフェクターの5％未満）でありながら、グループ1 ILCは、生来のエフェクターの約80％を占めています。これらの集団は、ILC集団の広く発現される細胞表面マーカーを用いて選別しました。その結果、肝臓におけるILC集団が別に広く同様のものを見て選別しました。 シングルセル多重RT-qPCRを速やかにこれらの集団11の不均一性を調査するための最良の手法の一つとして浮上しています</s&gt;アップ。二つの主な特徴は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの技術を利用して決定されます。まず、クローンレベルを見て、明らかに類似した発達段階を示す細胞との比較のために、細胞特異的遺伝子発現を回復することが可能です。そして、遺伝子発現の予め選択された組み合わせを見ることによって、我々は、1つの時点での同時の遺伝子発現パターンに基づいて、新たな遺伝子特性を決定します。技術は、クローンレベルで行われるので、これらの態様は、さらに稀な集団に、多数の細胞のための発現データの多様な収集を可能にします。これにより、肝臓におけるILC異質性が適切に評価することができます。 次に、グローバルILC表現型を有するすべての細胞を選別することにより、肝臓ILC集団の複数の遺伝子の発現の広範な概要は、それらが非常にまれな集団を表していても、得られます。マイクロ流体ベースのチップもで実験を可能にします細胞物質の少量。その結果、希少細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得ることができます。オンライン遺伝子特性分析ソフトウェアを用いて、細胞集団のクラスタと電位セルとの関係を調べることができます。これにより、機能テストは、in vivoレベルでクラスタリングデータを検証するために行うことができます。 遺伝子発現の十同じチップ3、11、12の数百以上の単一の細胞に同時に評価することができます。アッセイの設計は、実験の最長かつ最も重要な部分です。試験されるべき仮説に関連する遺伝子の決意は、適切な結果を得るために最も重要です。 （そのようなソートに使用される公知の表面マーカーなど）第二に、内部統制および特定のコントロールが必要とされています。これは、プライマー増幅特異性、増幅効率、およびtをテストすることが重要ですプライマー競争の彼が不在。セルの複数の遺伝子発現を同時に評価されるようにそのため、単一セル多重RT-qPCRをでの作業は、時間節約テクニックです。 すべてのセルのための試薬の同じチップとミックスを使用すると、操作のエラーの可能性を制限し、サンプル間の再現を可能にします。要するに、単一セル多重RT-qPCRをのさまざまな側面は​​、サンプルや遺伝子の幅広い感度の偉大なレベルで、クローンレベルでの信頼性の高い結果の生成を可能にします。得られた結果は、生物統計学的試験のための強力かつ堅牢なデータを提供しています。 これは、材料の非常に少量の作業を可能にし、徹底的な結果をもたらす方法のマイクロ流体態様に達成することができます。最後に、オンラインソフトウェアを使用して、所望の集団を比較することができます。

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

遺伝子発現の不均一性は、リンパ集団で調査する興味深い特徴です。これらの細胞における遺伝子発現は、細胞活性化、ストレス、又は刺激中に変化します。単一セルマルチプレックス遺伝子発現は遺伝子1、2、3の数十の同時評価を可能にします。単一細胞レベルでは、多重遺伝子発現は、集団の不均一4,5判定する。これは、成熟した細胞間の多様な前駆段階の可能性ミックスとも刺激に対する細胞応答の多様性の両方を決定することにより、人口の異質性の区別を可能にします。 先天性リンパ系細胞（ILC）は最近、免疫応答6、7の生来のエフェクターの集団として記載されています。 ILC彼のこのプロトコルでは、細胞の不均一paticコンパートメントは恒常性の間に検討されています。 現在、遺伝子発現を評価するための最も広く使用される技術は、RT-qPCRのです。この方法は、一度に遺伝子発現1つの遺伝子のみを測定します。複数のセルを1つのテストのために必要とされるのでさらに、この方法は、遺伝子発現の不均一性を推定することができません。これは、集団の平均遺伝子発現の測定をもたらします。多数の遺伝子を評価する場合、RT-qPCRのは、時間、reagent-、およびサンプルのかかる方法になります。したがって、トレードオフがグローバル画像を欠落するリスクを増大させる、評価することができる遺伝子または細胞集団の数を制限します。 この原稿は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRには、これらの制限を克服するために使用することができる方法を記載しています。この技術は、最近のマイクロフルイディクス技術の進歩1、2から恩恵を受けています。マルチプレックスRT-qPCRをチップに起こる反応はEXCありませんナノリットルレベルをEED。したがって、単一細胞遺伝子発現、ならびに同時に複数の遺伝子の発現、reagent-、試料 - 、および費用対効果の高い方法で行うことができます。異なる発達段階で、または異なる条件4,5の下で集団内の細胞のサブセット間クローンレベルでの細胞遺伝子シグネチャーの不均一性をテストすることができます。単一細胞レベルでの条件の数が多い希少な集団での作業はもはや制限ではありません。

リンパ系集団は、遺伝子発現に大きな多様性を示します。このプロトコルでは、肝臓ILC区画の不均一は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を用いて調べました。他の遺伝子発現技術とは異なり、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を同時に、さらに希少、いくつかの集団での作業を可能にします。クローンレベルで高感度に結合されたこの特異?...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...