Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
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This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

모든 동물 실험은 프랑스 농업 장관과 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 파스퇴르 연구소 안전위원회의 승인되었습니다. 1. 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 준비합니다 <ol><li> 구체적인 역 전사 완충액 5.0 ㎕의 낮은 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) TE 완충액 (10 mM의 TE 용액의 pH 8, 0.1 mM의 EDTA 용액 13 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에 미리 증폭 믹스 준비 0.2 μM 여과 )과의 Taq DNA 중합 효소 웰 당 ...

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	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

이 프로토콜은 클론 수준에서 완전한 유전자 발현 정보를 획득하는 방법을 설명한다. 여기, 우리가 간 ILC 함 이질성을 조사 하였다. (넓게 표현 ILC 표면 마커에 기초하여) 상이한 ILC 인구 단세포 정렬 후, 샘플을 특정 사전 선택된 유전자 사전 증폭 하였다. 이어서, 수득 된 cDNA와 프라이머를 멀티 플렉스 RT-qPCR의 마이크로 유체 칩 상에 로딩 하였다. 마지막으로, 우리는 48 하나의 세포에서 48 다른 ?...

지난 몇 년 동안, 선천성 림프 세포 (ILCs)는 점점 더 조사되었다. 항원 특이 적 수용체의 부족에도 불구하고, 그들은 림프 계보에 속하는 조직 항상성 및 염증 중요한 센티넬 나타낸다. ILCs 현재 특정 전사 인자 결합의 발현과 사이토 카인 (6, 7)을 생성하는 능력에 따라 세 개의 그룹으로 분할된다. ILCs 특정 사이토 카인 생산 8, 9를 통해 다양한 기관에서 다수의 항상성 및 병태 생리 학적 상황에 기여한다. 이러한 세포의 역할을 이해 할 수있게하기 위해, 기관마다 다양한 ILC 개체군을 결정하고, 그 발달 관계를 파악하는 것이 중요하다. 또한, 서로 다른 서브 세트들 사이에서 가소성 현상은 서로 관련되어있다. 이질성을 연구하여한 기관에 존재하는 세포, 그들의 성숙 단계를 구분하고, 특정 기능을 구별 할 수있다. 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 기술을 설명하기 위해 간 ILCs는 같은 ILC 그룹 (유형 1 ILC) (10) 내 자신의 이질성에 특히 중점을두고 선택되었다. 첫째, 유동 세포 계측법을 사용하여, 세 가지 ILC 인구 간 특징 하였다. 다른 두 집단 간 희귀 ILC 인구 (선천성 이펙터의 5 % 미만) 동안 1 군 ILC는 타고난 이펙터의 약 80 %를 나타낸다. 그 인구는 ILC 인구의 널리 표현 세포 표면 마커를 사용하여 분류 하였다. 그 결과, ILC 집단 간 다른 대체로 유사 하나 볼 정렬. 싱글 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 신속하게 이러한 인구 (11)의 이질성을 조사하기 위해 가장 좋은 방법 중 하나로 떠오르고있다 </s&gt;입니다. 두 가지 특성은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 기술을 활용하여 결정된다. 우선, 클론 레벨보고함으로써, 외관상 유사한 발달 단계를 표시 셀 간의 비교를 위해 셀 고유의 유전자 발현을 복구 할 수있다. 그 후 유전자 발현의 미리 선택된 조합을 보면, 우리는 하나의 시점에서 동시의 유전자 발현 패턴에 기초하여 새로운 유전자의 서명을 결정할 것이다. 기술이 클론 레벨에서 수행되기 때문에, 이러한 측면은도 드문 인구에, 다수의 셀에 대한 발현 다양한 데이터의 수집을 허용한다. 이것에 의해, 간 ILC 이질성 적절히 평가 될 수있다. 다음으로, 글로벌 ILC 표현형의 모든 세포를 분류함으로써, 간이 ILC 인구 다중 유전자 발현의 넓은 개요가 극히 드문 인구를 나타내는 경우에도 얻어진다. 미세 유체 기반 칩도 함께 실험을 할 수 있습니다셀 재가 소량. 결과적으로, 희귀 세포 집단의 유전자 발현 프로파일을 얻을 수있다. 온라인 유전자 서명 분석 소프트웨어 세포군 및 전위 클러스터 셀의 관계를 사용하는 것이 검토된다. 결과적으로, 기능 시험은 생체 레벨에서 클러스터 데이터를 검증하기 위해 수행 될 수있다. 유전자 발현 수십 동일한 칩 (3), 11, 12에서 수백 이상의 단셀에 부수적으로 평가 될 수있다. 분석의 디자인 실험의 가장 길고 가장 중요한 부분입니다. 테스트 할 가설에 관련된 유전자의 판정이 적절한 결과를 얻기 위해 가장 중요하다. 둘째, 특정 컨트롤 (예 : 정렬에 사용 알려진 표면 마커 등) 내부 통제가 필요하다. 이 프라이머 증폭 특이성, 증폭의 효율 및 t을 테스트하기 위해 매우 중요하다프라이머 경쟁 그는 부재. 셀의 다중 유전자 발현을 동시에 평가된다 따라서, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 작업하면, 절약 해주는 기술이다. 모든 셀에 대한 시약의 동일한 칩과 믹스를 사용하여 조작 가능한 오류를 제한하고 샘플 간의 재현성 수 있습니다. 전체적으로 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 다른 측면은 샘플 및 유전자의 다양한 감도의 중대한 레벨, 클론 레벨에서 신뢰성이 높은 결과의 생산을 허용한다. 얻어진 결과는 biostatistical 테스트를위한 강력하고 견고한 데이터를 제공합니다. 이는 물질의 매우 작은 양의 작업을 허용하고 완전한 결과를 유도하는 방법의 미세 형태로 달성 될 수있다. 마지막으로, 온라인 소프트웨어를 사용하면, 목적하는 집단과 비교하는 것이 가능하다.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

유전자 발현의 이질성은 림프 인구에서 조사 할 수있는 흥미로운 기능입니다. 이들 세포에서의 유전자 발현은 세포 활성화, 스트레스, 또는 자극하는 동안 변화한다. 단일 셀 다중 유전자 발현 유전자 1, 2, 3, 수십의 동시 평가를 가능하게한다. 단일 세포 수준에서 다중 유전자 발현 인구 얼룩이 -4,5- 판정한다. 그것은 성숙 세포 사이의 다양한 전구체 단계의 가능성 혼합 또한 자극에 대한 세포 반응의 다양성을 모두 결정함으로써 인구의 이질성의 구별이 가능합니다. 선천성 림프 세포 (ILC)는 최근 면역 반응 6,7 내재 이펙터 집단으로 설명되었다. ILC 그는이 프로토콜에서, 세포 이질성상호 작용이있다 함은 항상성 동안 조사 하였다. 현재, 유전자 발현을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 RT-qPCR에있다. 이 방법은 측정의 유전자 발현 한 번에 하나의 유전자. 복수의 셀이 하나의 시험이 필요하기 때문에 또한이 방법은 유전자 발현의 이질성을 예측할 수 없다. 이는 집단의 평균 유전자 발현의 측정을 이끈다. 유전자의 다수의 평가시, RT-qPCR에이 시간이, reagent- 및 샘플이 걸리는 방법이된다. 따라서, 트레이드 오프는 글로벌 화상 누락의 위험을 증가시키는, 평가 될 수있는 유전자 또는 세포 집단의 수를 제한한다. 이 논문은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 이러한 한계를 극복 할 수있는 방법을 설명한다. 이 기술은 최근 미세 유체 기술 진보 1, 2에서 혜택을 받았다. 멀티 플렉스 RT-qPCR에 칩에서 발생하는 반응은 EXC을하지 않습니다나노 리터 수준을 EED. 따라서, 단일 세포 유전자 발현뿐만 아니라, 동시에 복수의 유전자 발현은 메가 샘플하는 reagent- 수행하고 비용 효율적인 방식으로 할 수있다. 이 5 가지 개발 단계 또는 상이한 조건 하에서 4 집단 내 세포의 서브 세트 사이의 클론 세포 수준에서 유전자 서명 이질성을 테스트 할 수있다. 단일 세포 수준에서 조건의 많은 수의 희귀 한 집단에서 작업하는 것은 더 이상 제한되지 않습니다.

림프 인구는 유전자 발현의 다양성을 표시합니다. 이 프로토콜에서, 간 ILC 실 얼룩이은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 사용하여 조사 하였다. 다른 유전자 발현 기술과는 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 동시에조차 희귀 여러 집단 작업을 허용한다. 클론 수준에서 높은 감도와 결합이 특이도는 인구 내에서 유전자 서명의 차이의 조사 및 희...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...