Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Alle dyreforsøk ble godkjent av ved Pasteur-instituttet Safety Committee i samsvar med det franske landbruksdepartementet og EU-retningslinjene. 1. Forbered en 96-brønns Single-celle sortering Plate <ol><li> Fremstille pre-amplifikasjon blandingen i et 1,5 ml rør ved tilsetning av 5,0 mL av spesifikk retro-transkripsjon-buffer, 1,3 ul av lavt etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) TE-buffer (10 mM TE-løsning, pH 8, og 0,1 mM EDTA-løsning; 0,2 pM filtrert ), og 0,2 ul Taq DNA-polymerase per brønn (Figu...

<ol>
	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

Denne protokollen beskriver hvordan du skaffer uttømmende genekspresjon informasjon på klonale nivå. Her undersøkte vi lever ILC rommet heterogenitet. Etter én enkelt celle sortering av ulike ILC populasjoner (basert på aner uttrykt ILC overflatemarkører), prøvene ble pre-amplifisert for spesifikke forhåndsvalgte gener. Deretter ble det oppnådde cDNA og primere applisert på en multipleks RT-qPCR mikrofluid chip. Til slutt, erholdt vi ekspresjon av 48 forskjellige gener fra 48 enkle celler. Genuttrykk resultat...

I løpet av de siste årene, har medfødte lymfoide celler (ILCs) blitt stadig mer etterforsket. Til tross for sin mangel på antigen-spesifikke reseptorer, de tilhører lymfoidlinjen og representerer viktige voktere for vev homeostase og betennelse. ILCs er i dag delt inn i tre grupper basert på deres uttrykk av spesifikke transkripsjonsfaktorkombinasjoner og på deres evne til å produsere cytokiner 6, 7. ILCs bidra til en rekke homeostatiske og patofysiologiske situasjoner i ulike organer via spesifikk cytokinproduksjon 8, 9. For å være i stand til å forstå rollen til disse celler, er det viktig å bestemme de forskjellige ILC subpopulasjoner pr organ og for å identifisere deres utviklingsmessige relasjoner. I tillegg har fenomener av plastisitet mellom de forskjellige delsettene er relatert. Ved å studere den heterogenitetenav cellene som er tilstede i ett organ, er det mulig å avgrense deres stadium av modning og for å skille sine spesifikke funksjoner. For å illustrere teknikken av encellede multipleks RT-qPCR ble lever ILCs valgt, med særlig vekt på deres heterogenitet innenfor samme ILC gruppe (type 1 ILC) 10. Først, ved bruk av flowcytometri, ble tre distinkte populasjoner ILC karakterisert ved leveren. Gruppe 1 ILC representerer rundt 80% av de medfødte effektorer, mens de to andre bestander er sjeldne lever ILC populasjoner (mindre enn 5% av de medfødte effektorer). Disse bestandene ble sortert ved hjelp av allment uttrykt celleoverflatemarkører ILC populasjoner. Som et resultat, sortert ILC populasjoner i leveren ser stort sett lik en til en annen. Encellede multipleks RT-qPCR har dukket opp som en av de beste teknikker for å komme til bunns i den heterogeniteten av disse populasjonene 11 </sopp&gt;. To viktigste egenskapene bestemmes ved å dra nytte av den encellede multipleks RT-qPCR teknikk. Først ved å se på klonalt nivå, er det mulig å gjenvinne celle-spesifikk genekspresjon for sammenligning mellom celler som tilsynelatende viser tilsvarende utviklingsstadier. Deretter, ved å se på en forhåndsvalgt kombinasjon av genuttrykk, vil vi bestemme nye gen signaturer basert på samtidige genuttrykksmønster på ett tidspunkt. Disse trekkene tillater oppsamling av en rekke ekspresjonssystemer data for et stort antall celler, selv på sjeldne populasjoner, ettersom teknikken utføres ved klonal nivå. Derved kan ILC heterogenitet i leveren være tilstrekkelig vurdert. Deretter ved å sortere alle cellene med en global ILC fenotype, er en bred oversikt over flere genekspresjon av leveren ILC populasjoner innhentet, selv om de representerer svært sjeldne populasjoner. En microfluidic-basert chip tillater eksperimentering med endaen liten mengde av cellemateriale. Som en konsekvens, kan genekspresjonsprofiler av sjeldne cellepopulasjoner oppnås. Ved hjelp av online-genet signaturanalyse programvare, cellebefolkningsgrupper og potensielle celle relasjoner kan bli undersøkt. Følgelig kan funksjonstester utføres for å validere clustering data på in vivo nivå. Titalls genekspresjon kan bli vurdert samtidig på flere hundre eller flere enkeltceller på samme brikke 3, 11, 12. Utforming av analysen er den lengste og mest viktig del av forsøket. Bestemmelsen av de gener som er relevante for den hypotese som skal testes er av vesentlig betydning for å oppnå relevante resultater. Dernest er intern kontroll (for eksempel kjente overflatemarkører som brukes til sortering) og spesifikke kontroller nødvendig. Dette er avgjørende for å teste primer amplifikasjon spesifisitet, effektiviteten av forsterkningen, og than fravær av primer konkurranse. Derfor arbeider med enkelt-celle multipleks RT-qPCR er en tidsbesparende teknikk, som multippel-genekspresjon av en celle vurderes samtidig. Ved å bruke den samme brikke og blanding av reagenser for alle celler som begrenser de mulige feil ved manipulering og muliggjør reproduserbarhet mellom prøver. Alt i alt har de forskjellige aspektene av enkelt-celle multipleks RT-qPCR muliggjør fremstilling av høyt pålitelige resultater på klonalt nivå, med en stor grad av følsomhet for et bredt spekter av prøver og gener. Resultatene gir kraftige og robuste data for biostatistiske tester. Dette kan oppnås på grunn av den mikrofluid aspekt av fremgangsmåten, som gjør det mulig å arbeide med meget små mengder av materiale og fører til uttømmende resultater. Til slutt, ved hjelp av online programvare, er det mulig å sammenligne de ønskede populasjoner.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Genuttrykk heterogenitet er en interessant funksjon for å undersøke i lymfoide populasjoner. Genekspresjon i disse cellene varierer i løpet av celleaktivering, stress, eller stimulering. Enkeltcelle multipleks genekspresjon muliggjør samtidig vurdering av flere titalls gener 1, 2, 3. Ved enkelt-celle-nivå, bestemmer multipleks genekspresjon befolkning heterogenitet 4, 5. Det gir mulighet for æren av befolkningen heterogenitet ved å bestemme både sannsynlig blanding av ulike forløper etapper blant modne celler og også mangfoldet av celle responser på stimuli. Medfødte lymfoide celler (ILC) har nylig blitt beskrevet som en befolkning på medfødte effektorer i immunresponsen 6, 7. I denne protokollen, celle heterogenitet av ILC hanpatic Rommet er undersøkt i løpet av homeostase. Foreløpig er den mest brukte teknikken til å vurdere genekspresjon er RT-qPCR. Denne metoden måler genekspresjon bare ett gen om gangen. I tillegg kan denne fremgangsmåte ikke anslå heterogenitet av genekspresjon, ettersom multiple celler er nødvendig for en test. Dette fører til måling av den gjennomsnittlige genekspresjon av befolkningen. Ved vurdering av et stort antall gener, blir RT-qPCR en tids, reagens og prøve krevende metode. Derfor avveiningene begrense antallet gener eller cellepopulasjoner som kan evalueres, øker risikoen for mangler det globale bildet. Dette manuskriptet beskriver hvordan enkeltcelle multipleks RT-qPCR kan anvendes for å overvinne disse begrensningene. Denne teknikken har dratt nytte av senere MicroFluidics teknologiske fremskritt 1, 2. Reaksjoner som opptrer hos multipleks RT-qPCR chips ikke exceed den nanoliter-nivå. Derfor, encellede genekspresjon, så vel som samtidig multippel genekspresjon, kan utføres i et reagens, prøve-, og kostnadseffektiv måte. Det er mulig å teste celle-genet signatur heterogenitet på den klonale nivå mellom celleundergrupper innenfor en befolkning på forskjellige utviklingsstadier eller under forskjellige forhold 4, 5. Arbeider på sjeldne populasjoner med et stort antall forhold på enkeltcellenivå er ikke lenger en begrensning.

Lymfoide populasjoner viser stort mangfold i genuttrykk. I denne protokollen, ble leveren ILC rommet heterogenitet undersøkt ved hjelp av encellede multipleks RT-qPCR genekspresjon. I motsetning til andre genekspresjon teknikker, tillater encellede multipleks RT-qPCR-genekspresjon arbeid på flere populasjoner, selv de sjeldneste, samtidig. Dette spesifisitet, kombinert med høy følsomhet ved klonal nivå, åpner for etterforskningen av forskjeller i genet underskrifter innen en popula...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Denne protokollen beskriver hvordan du vurdere uttrykk for et stort utvalg av gener ved klonal nivå. Encellede RT-qPCR produserer meget pålitelige resultater med en sterk følsomhet for hundrevis av prøver og gener.

Encellede Gene Expression Bruke Multiplex RT-qPCR å karakter heterogenitet av sjeldne lymfoide populasjoner

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser av sirkulerende mirnas i Irritabel tarm syndrom oppdages ved hjelp av en multiplekset Høy throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studier av celle-regulert genuttrykk av to komplementære cellesynkroniseringsprotokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Eksempel forberedelse og analyse av RNASeq-baserte genuttrykk Data fra sebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Måle genuttrykk i bombet Bygg Aleurone lag med økt gjennomstrømming

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode for å styre og analysere Gene Expression mønstre i celle til celle interaksjoner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Bruke musen Oocytes å vurdere menneskelige gen funksjon under meiose jeg

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...