Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comité de Segurança do Instituto Pasteur, de acordo com o Ministério da Agricultura francês e as orientações da UE. 1. Prepare uma placa de classificação de célula única de 96 poços <ol><li> Prepare a mistura de pré-amplificação em um tubo de 1,5 ml por adição de 5,0 mL de tampão de retro-transcrição específica, 1,3 ul de baixa ácido etilenodiaminotetracético tampão (EDTA) de TE (10 solução TE mM, pH 8, e EDTA 0,1 mM; 0,2 uM filtra...

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	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. 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Este protocolo descreve como obter a expressão do gene de informação exaustiva ao nível clonal. Aqui, nós investigamos fígado ILC heterogeneidade compartimento. Após a triagem de uma única célula de diferentes populações ILC (com base em marcadores de superfície ILC amplamente expressas), as amostras foram pré-amplificada para genes pré-selecionados específicos. Em seguida, o ADNc e os iniciadores obtidos foram carregados num chip de microfluidos de RT-qPCR multiplex. Finalmente, obteve-se a expressão de...

Ao longo dos últimos anos, as células linfóides inatas (CIT) têm sido cada vez mais investigada. Apesar da sua falta de receptores específicos para o antigénio, eles pertencem à linhagem linfóide e representam sentinelas importantes para a homeostase do tecido e inflamação. CIT está dividida em três grupos com base na sua expressão de combinações específicas do factor de transcrição e na sua capacidade para produzir citocinas 6, 7. ILCs contribuir para inúmeras situações homeostáticos e fisiopatológicos em diversos órgãos através da produção de citocinas específicas 8, 9. Para ser capaz de compreender o papel destas células, é importante para determinar as várias subpopulações ILC por órgãos e identificar as suas relações de desenvolvimento. Além disso, os fenómenos de plasticidade entre os diferentes subconjuntos foram relacionados. Ao estudar a heterogeneidadedas células presentes em um órgão, é possível delimitar o seu estádio de maturação e de distinguir as suas funções específicas. Para ilustrar a técnica de multiplex de uma única célula RT-qPCR, ILCs hepáticas foram escolhidos, com especial ênfase na sua heterogeneidade dentro do mesmo grupo ILC (tipo 1 ILC) 10. Em primeiro lugar, através do uso de citometria de fluxo, três populações distintas ILC foram caracterizados no fígado. Grupo 1 ILC representa cerca de 80% dos efectores inatos, enquanto as duas outras populações são raras populações ILC hepáticas (menos do que 5% do efectores inatos). Essas populações foram classificados usando marcadores da superfície celular amplamente expressos das populações ILC. Como resultado, as populações classificadas ILC no fígado um olhar muito semelhante a outro. Multiplex de uma única célula RT-qPCR tem emergido como uma das melhores técnicas para investigar imediatamente a heterogeneidade dessas populações 11 </s-se&gt;. Duas características principais são determinados tomando vantagem do multiplex de uma única célula a técnica de RT-qPCR. Em primeiro lugar, ao olhar para o nível clonal, é possível recuperar a expressão do gene específico da célula para a comparação entre as células que aparentemente mostrar estágios de desenvolvimento semelhantes. Então, ao olhar para uma combinação pré-selecionada da expressão do gene, vamos determinar novas assinaturas genéticas com base em padrões de expressão gênica simultâneas em um ponto do tempo. Estes aspectos permitir a recolha de uma grande variedade de dados de expressão para um grande número de células, mesmo em populações raros, uma vez que a técnica é realizada ao nível clonal. Desse modo, a heterogeneidade ILC no fígado pode ser adequadamente avaliado. Em seguida, classificando todas as células com um fenótipo ILC global, uma ampla visão geral da expressão de múltiplos genes das populações ILC fígado é obtido, apesar de representarem populações extremamente raros. Um chip à base de microfluídica permite a experimentação com aindauma pequena quantidade de material celular. Como consequência, os perfis de populações de células raras de expressão de genes pode ser obtida. Usando o software on-line assinatura gene análise, aglomerados populacionais celular e relações celulares potenciais podem ser investigadas. Consequentemente, testes de funcionamento podem ser realizados para validar os dados de agrupamento no nível in vivo. Dezenas de expressão dos genes poderia ser avaliado concomitantemente em centenas ou mais células individuais no mesmo chip 3, 11, 12. Projeto do ensaio é a parte mais longa e mais importante do experimento. A determinação dos genes relevantes para a hipótese de ser testado é fundamental para obter resultados relevantes. Em segundo lugar, são necessários controles internos (como marcadores de superfície conhecidos utilizados para a classificação) e controles específicos. Este aspecto é crucial para testar a especificidade do iniciador de amplificação, a eficiência da amplificação, e tele ausência de concorrência primer. Por conseguinte, o trabalho com multiplex de uma única célula de RT-qPCR é uma técnica que economiza tempo, como a expressão de vários genes de uma célula é avaliado ao mesmo tempo. Usando o mesmo chip e mistura de reagentes para todas as células limita os possíveis erros de manipulação e permite uma reprodutibilidade entre as amostras. No seu conjunto, os diferentes aspectos do multiplex de uma única célula de RT-qPCR permite a produção de resultados altamente fiáveis ​​ao nível clonal, com um grande nível de sensibilidade para uma ampla variedade de amostras e genes. Os resultados obtidos oferecem dados poderosa e robusta para testes biostatistical. Isto pode ser conseguido devido ao aspecto do método de microfluidos, que permite que o trabalho em muito pequenas quantidades de material e leva a resultados exaustivos. Finalmente, utilizando software de linha, é possível comparar as populações desejados.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

a expressão do gene heterogeneidade é uma característica interessante para investigar em populações linfóides. A expressão de genes nestas células varia durante a activação celular, stress, ou a estimulação. Unicelular expressão do gene multiplex permite a avaliação simultânea de dezenas de genes 1, 2, 3. Ao nível de uma única célula, a expressão do gene multiplex determina população heterogeneidade 4, 5. Ele permite a distinção de heterogeneidade da população determinando tanto a mistura provável de diversas fases precursoras entre células maduras, e também a diversidade de respostas celulares a estímulos. Células linfóides inatos (ILC) foram recentemente descritas como uma população de efectores inatos da resposta imunitária 6, 7. Neste protocolo, a heterogeneidade célula do ILC elecompartimento Patic é investigada durante a homeostase. Atualmente, a técnica mais utilizada para avaliar a expressão do gene é RT-qPCR. Esta expressão do gene método mede apenas um gene de cada vez. Além disso, este método não é possível estimar a heterogeneidade de expressão de gene, uma vez que várias células são necessários para um teste. Isto leva-se à medição da expressão do gene da média da população. Ao avaliar um grande número de genes, RT-qPCR torna-se um, e método de tempo- reagent-, consumindo-amostra. Assim, os trade-offs limitar o número de genes ou populações de células que podem ser avaliados, aumentando o risco de perder a imagem global. Este manuscrito descreve como multiplex de uma única célula de RT-qPCR pode ser utilizada para ultrapassar estas limitações. Esta técnica tem se beneficiado da recente microfluidics avanços tecnológicos 1, 2. Reações que ocorrem no multiplex chips de RT-qPCR não exceed o nível de nanoliter. Assim, a expressão do gene de uma única célula, bem como a expressão de genes múltiplos em simultâneo, pode ser realizada num reagent-, de amostra, e forma rentável. É possível testar génica em células de assinatura heterogeneidade ao nível clonal entre subconjuntos de células dentro de uma população em diferentes estágios de desenvolvimento ou sob diferentes condições de 4, 5. Trabalhando em populações raras com um grande número de condições do nível de uma única célula não é uma restrição.

populações linfóides exibir grande diversidade de expressão do gene. Neste protocolo, a heterogeneidade do fígado compartimento ILC foi investigado utilizando multiplex de uma única célula RT-qPCR expressão do gene. Ao contrário de outras técnicas de expressão de genes, de uma única célula em multiplex RT-qPCR permite a expressão do gene de trabalho em várias populações, mesmo o mais raro, ao mesmo tempo. Esta especificidade, juntamente com uma elevada sensibilidade ao n...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...