Name: single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом Института Пастера вопросам безопасности в соответствии с французским министерством сельского хозяйства и руководства ЕС. 1. Подготовить 96-луночного одноклеточные Сортировка плиты <ol><li> Подготовка предварительной амплификац?...

<ol>
	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

Этот протокол описывает, как получить исчерпывающую информацию экспрессии генов на уровне клонального. Здесь мы исследовали печени ILC отделения гетерогенность. После сортировки одноклеточного различных ILC популяций (на основе широко экспрессируется ILC поверхностных маркеров), образц...

За последние несколько лет, врожденные лимфоидные клетки (КМО), так как все больше и больше исследованы. Несмотря на отсутствие антиген-специфических рецепторов, они принадлежат к лимфоидного и представляют собой важные сторожей для гомеостаза тканей и воспаления. КМО в настоящее время разделены на три группы в зависимости от их экспрессии специфических комбинаций факторов транскрипции и на их способности продуцировать цитокины , 6, 7. КМО способствуют многочисленные гомеостаза и патофизиологических ситуаций в различных органах через конкретного производства цитокина 8, 9. Для того, чтобы быть в состоянии понять роль этих клеток, важно, чтобы определить различные ILC субпопуляции за орган и определить их отношения в области развития. Кроме того, явления пластичности между различными подмножествами были связаны между собой. Изучая гетерогенностьиз клеток, присутствующих в одном органе, можно разграничить стадии их созревания и различать их специфические функции. Чтобы проиллюстрировать технику одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР, печеночные КМО были выбраны, с особым акцентом на их неоднородности в пределах одной группы ILC (тип 1 ILC) 10. Во-первых, за счет использования проточной цитометрии, три различных ILC популяции характеризуются в печени. Группа 1 МКТ представляет около 80% врожденных эффекторов, в то время как две другие группы населения являются редкими печеночные ILC популяции (менее 5% от всех врожденных эффекторов). Эти группы населения были отсортированный с использованием широко экспрессируется клетками поверхностных маркеров ILC популяций. В результате, отсортированный ILC популяции в печени широко смотреть похожи одна на другую. Одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР стала одним из лучших методов , чтобы оперативно расследовать разнородность этих групп населения 11 </sвверх&gt;. Две основные характеристики определяются воспользовавшись одноклеточного мультиплекс техники RT-КПЦР. Во-первых, глядя на клонального уровне, то можно восстановить экспрессию генов клеточного специфичные для сравнения между клетками, которые, по-видимому выглядеть примерно стадии развития. Затем, посмотрев на заранее выбранной комбинации экспрессии генов, мы будем определять новые сигнатуры генов на основе одновременных паттернов экспрессии генов в один момент времени. Эти аспекты позволить сбор широкого спектра данных выражение для большого количества клеток, даже в редких популяций, так как этот метод выполняется на клонального уровне. Таким образом, МКТ гетерогенность в печени может быть адекватно оценена. Далее, путем перебора всех клеток с глобальной ILC фенотипа, широкий обзор экспрессии нескольких генов печени ILC популяций получается, несмотря на то, что они представляют собой крайне редкие популяции. Чип Микрожидкостных на основе позволяет экспериментировать даже снебольшое количество клеточного материала. Как следствие, могут быть получены профили экспрессии генов в популяциях редких клеток. С помощью онлайн программного обеспечения для анализа генов подписи, кластеры клеточной популяции и потенциальные отношения клеток могут быть исследованы. Следовательно, функциональные тесты могут быть выполнены для проверки данных кластеризации на уровне в естественных условиях. Десятки экспрессии генов могут быть оценены одновременно на сотни или более отдельных клеток на том же чипе 3, 11, 12. Дизайн анализа является самой длинной и самой важной частью эксперимента. Определение генов, имеющих отношение к проверяемой гипотезы имеет первостепенное значение для получения соответствующих результатов. Во-вторых, необходимы внутреннего контроля (например, известных поверхностных маркеров, используемых для сортировки) и конкретные меры контроля. Это очень важно, чтобы проверить праймера амплификации специфичность, эффективность амплификации, а Тон отсутствие конкуренции праймера. Таким образом, работа с одноклеточной мультиплексной ОТ-кПЦР является экономия времени методика, как и выражение нескольких генов клетки оценивается в то же время. Используя тот же чип и смесь реагентов для всех ячеек ограничивает возможные ошибки манипуляций и позволяет воспроизводимости между образцами. В целом, различные аспекты одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР позволяет производить высоконадежных результатов на клонального уровне, с большим уровнем чувствительности для широкого спектра образцов и генов. Полученные результаты предлагают мощные и надежные данные для биостатистических испытаний. Это может быть достигнуто за счет микрожидком аспекте способа, который позволяет для работы на очень малых количеств материала и приводит к исчерпывающих результатов. И, наконец, с помощью онлайн программного обеспечения, можно сравнить желательные популяции.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Экспрессия генов гетерогенность является интересной особенностью для изучения лимфоидных популяций. экспрессии генов в этих клетках изменяется в процессе активации клеток, стресса или раздражения. Выражение мультиплекс ген Одноклеточный позволяет одновременно оценку десятков генов 1, 2, 3. На уровне одноклеточных, мультиплекс экспрессия генов определяет население гетерогенность 4, 5. Это позволяет проводить различия неоднородности населения путем определения как вероятное сочетание различных стадий предшественников среди зрелых клеток, а также разнообразие ответов клетки на раздражители. Врожденные лимфоидных клеток (ILC) были недавно описаны как совокупность врожденных эффекторы иммунного ответа 6, 7. В этом протоколе клетка гетерогенность ILC онpatic отсек исследуется в течение гомеостаза. В настоящее время наиболее широко используемый метод для оценки экспрессии гена RT-КПЦР. Это выражение гена измеряет метод только один ген, в то время. Кроме того, этот метод не может оценить гетерогенность экспрессии генов, так как множественные клетки необходимы для одного теста. Это приводит к измерению средней экспрессии генов популяции. При оценке большого количества генов, RT-КПЦР становится по времени, reagent-, и образец затрат метод. Следовательно, компромиссы ограничить число генов или клеточных популяций, которые могут быть оценены, увеличивая риск упустить глобальную картину. Эта рукопись описывает, как одноклеточные мультиплексной ОТ-КПЦР может быть использован для преодоления этих ограничений. Этот метод извлек выгоду из недавней микрофлюидики технологических достижений 1, 2. Реакции, происходящие в мультиплекс RT-КПЦР чипы не отлEed на nanoliter уровне. Следовательно, экспрессия генов одноклеточных, а также одновременное выражение множественный ген, может быть выполнена в reagent-, ственном образце, и экономически эффективным образом. Можно протестировать ген клеток подписи гетерогенность на клонального уровне между клеточными подмножествах в популяции на разных стадиях развития или в разных условиях , 4, 5. не Работая на редких популяций с большим числом условий на уровне одной клетки больше не является ограничением.

Лимфоидные популяции отображать большое разнообразие в экспрессии генов. В этом протоколе, печени МКТ отделение гетерогенность исследовали с использованием экспрессии гена RT-КПЦР одноклеточного мультиплекс. В отличие от других методов экспрессии генов, экспрессия ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Этот протокол описывает, как оценить экспрессию большого массива генов на клоновых уровне. Одноклеточный RT-КПЦР производит весьма надежные результаты с сильной чувствительностью для сотен образцов и генов.

Одноклеточный экспрессии генов с помощью Multiplex RT-КПЦР к характеризации гетерогенности редких популяций лимфоидных

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Возмущения Циркулирующие микроРНК при синдроме раздраженного кишечника Обнаружен Использование Multiplexed высокой пропускной способностью экспрессии генов платформы

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Измеряя экспрессии генов в бомбардировке ячменя Aleurone слои с повышенной пропускной способностью

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

С помощью мыши яйцеклеток для оценки человеческого гена функции во время мейоза я

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...