Name: immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers
Uploaded: 2016-12-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers at JoVE.com

Yazarlar VS NIH / NINDS R01 NS069861 ve NJCBIR CBIR14IRG024 destek kabul etmek istiyorum

Elektrofizyoloji sırasında 1. Biocytin Dolum NOT: okuyucular burada üzerine özenli değil temel yama-kelepçe kayıt teknikleri ve enstrümantasyon 19-22, alternatif kaynaklara başvurabilirsiniz. Burada ayrıntılı adımlar yama-kelepçe kayıtları için ekipman ve prosedürler zaten kurulmuş olduğunu varsayalım ve açıklama biocytin doldurma ve post-hoc immün ilgili ayrıntılar ile sınırlı olacak. Bu yazıda belirtilen tüm deneyler fareler üzerinde gerçekleştiri...

<ol>
	<li>Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+slides+and+drawings+of+cajal.">The histological slides and drawings of cajal.</a> Front Neuroanat. 4, 9 (2010).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics:+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li><li>Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Armstrong, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basket+cell+dichotomy+in+microcircuit+function.">Basket cell dichotomy in microcircuit function.</a> J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).</li><li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons:+chandelier+versus+basket+cells.">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).</li><li>Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decrease+in+tonic+inhibition+contributes+to+increase+in+dentate+semilunar+granule+cell+excitability+after+brain+injury.">Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury.</a> J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).</li><li>Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-containing+chandelier+and+basket+cell+boutons+have+distinctive+modes+of+maturation+in+monkey+prefrontal+cortex.">Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex.</a> J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).</li><li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+cannabinoid-sensitive+interneurons+undergo+unique+and+selective+strengthening+of+mutual+synaptic+inhibition+in+experimental+epilepsy.">Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).</li><li>Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+total+molecular+layer+interneurons+mediate+cannabinoid-sensitive+inhibition.">Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition.</a> Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).</li><li>Varga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+fission+of+parvalbumin+interneuron+classes+during+fast+network+events.">Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons:+activity-dependent+promoters+have+come+of+age.">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).</li><li>Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ivy+and+neurogliaform+interneurons+are+a+major+target+of+mu-opioid+receptor+modulation.">Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation.</a> J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).</li><li>Szabadics, J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+mossy+fiber+innervation+of+GABAergic+cells+in+the+hippocampus.">Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus.</a> J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).</li><li>Iball, J., Ali, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoid+Release+Modulates+Electrical+Coupling+between+CCK+Cells+Connected+via+Chemical+and+Electrical+Synapses+in+CA1.">Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1.</a> Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).</li><li>Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Ranjan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+detection+of+multiple+antigens+at+single+cell+resolution+using+antibodies+generated+from+the+same+species.">Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species.</a> Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).</li><li>Fuccillo, D. A., Sever, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).</li><li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+neuronal+microcircuits+in+acute+brain+slices+using+paired+patch-clamp+recordings.">Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).</li><li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).</li><li>Molnar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).</li><li>Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-clamp methods and protocols. , (2014).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons).">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons).</a> J Vis Exp. (91), e51706 (2014).</li><li>Jinno, S., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+characterization+of+hippocamposeptal+projecting+GABAergic+nonprincipal+neurons+in+the+mouse+brain:+a+retrograde+labeling+study.">Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study.</a> Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).</li><li>Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reduction+in+Cannabinoid-Sensitive+Heterotypic+Inhibition+of+Dentate+Basket+Cells+in+Epilepsy:+Impact+on+Network+Rhythms.">Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms.</a> Cereb Cortex. , (2015).</li><li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations.">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109 (2013).</li><li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+dentate+neurons+by+morphology+and+electrophysiology+in+hippocampal+slices:+granule+cells,+spiny+hilar+cells+and+aspiny+'fast-spiking'+cells.">Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells.</a> Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).</li><li>Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+intracellular+markers+for+combined+electrophysiological,+morphological+and+immunohistochemical+analyses.">Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses.</a> J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).</li></ol>

Protokol çerçevesinde kritik adımlar biocytin ile yamalı hücreyi Dolum morfoloji tam iyileşme sağlamak için en önemli adımdır. Hücrenin tam iyileşme için, dilimleme sırasında süreçlerin kopardığınızı en aza indirmek için en uygun dilim yönünü seçmek için esastır. Bu yönelim, inceleme altındaki devre ve hücre tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha sonra, biocytin dendrit ve akson yayılmaya için yeterli zaman tanımak esastır....

Beyin bireysel nöronal elementlerin yapısal ve işlevsel özellikleri çeşitlilik için bilinir. beyin fonksiyonu ve patoloji farklı nöron tiplerinin rolleri anlamak karakterizasyonu ve nöronların kesin kimlik gerektirir. aksonal arborization desen potansiyel postsinaptik hedefleri tanımlar iken Yapısal, somato-dendritik yere göre tanımlanan morfolojik özellikleri, belirli bir nöron alır potansiyel girişleri belirler. Nöronların yapısal çeşitlilik Ramon y Cajal seminal histolojik çalışmalar 1 günlerinden beri takdir edilmiştir. Tek hücreli kayıt tekniklerinin ortaya çıkışı, yapısal olarak farklı nöron ayrıca fırınlama desen ve sinaptik karakteristikleri bakımından farklılıklar gösterir ortaya koymuştur. Yapı ve fizyolojisi çeşitlilik GABAerjik inhibitör nöronlar 2,3 özellikle belirgindir. Buna ek olarak, bu structurall giderek daha açık hale gelmiştiry benzer nöronlar işlevsel farklılıkları 4 gelen farklı nörokimyasal işaretleri ve gösteri ifade edebilir. Benzer şekilde, aynı nörokimyasal işaretleri ile nöronlar farklı yapılar ve fonksiyonları 5-10 olabilir. Dolayısıyla, uygulamada, ağ nöronların işlev özelliklerinin analizi ve rolü, hem morfolojik ve nörokimyasal kimlik tanımlama gerektirmektedir. Hatta belirli nörokimyasal belirteçleri hedefleyen raportör fare hatları gelişine, o immünohistoloji 11 dayalı morfoloji ve alt tipi kimliğini belirlemek için genellikle gereklidir. akut beyin dilimleri kaydedilen hücreleri karakterize etmek için kullanılan standart yöntem, kayıt sırasında biocytin veya neurobiotin ile doldurun kayıtları aşağıdaki paraformaldehid bölümleri (PFA) düzeltmek ve morfolojisi ve sinir kimyasını ortaya çıkarmak için immünhistokimya kullanmaktır. dilim fizyolojisi için bölümlerin kalınlığı bu yana 300 mikron tipik olarakBir çok antikor bu derinlik tüm yol boyunca nüfuz başarısız daha çünkü veya dilimler biocytin ve nöro-kimyasal işaretlerin 12-14 için eş zamanlı olarak immün izin vermek için 60 um ya da daha az yeniden kesitli olması gerekir. Ne yazık ki, rezeksiyon zahmetlidir; Kesit sırasında doku kaybı riskini; ve morfolojik rekonstrüksiyon komplike doku farklı büzülmeden yol açabilir. Ayrıca, morfoloji ön bilgi hücreleri tarafından ifade edilmesi muhtemeldir aday işaretlerini daraltmak yardımcı olabilir. Biz ilk morfoloji geri kazanımı için ve daha sonra olası nörokimyasal belirteçlerin tanımlanması için bölümlerin seri işleme izin vermek standart biocytin immünohistolojisi protokolleri değiştirdiniz. İmmünohistokimya dokular ya da hücrelerin antijen dağılımının çalışmadır ve bir enzim, floresan etiketler, radyoaktif elementler, veya altın kolloid partiküller 15 ile görselleştirilebilir. prosedür Iözel olarak görselleştirme için birincil antikor hedefleme, ışıltılı ikincil antikorlar kullanılarak, ardından bir veya daha fazla spesifik antijenler, etiket ve yükseltmek için primer antikorlar kullanılarak nvolves. çakışma olmadan her bir ikincil antikorun flüoresans spektrumunu ayırt ihtiyacı nedeniyle, antijenlerin, sadece sınırlı sayıda eş zamanlı olarak kontrol edilebilir. Böylece, morfolojisi ön bilgi hücre sınıflandırma için aday nörokimyasal belirteçleri seçiminde yararlı olabilir. Kavramsal olarak, daha önce lekeli bölümlerinin seri işleme arkasındaki mantık, bir protein veya peptid için immün bir yapısal olarak bağımsız peptid 16 antijenite ve daha sonra immunolabeling engel olmamalıdır prensibine dayalıdır. müdahalenin olmaması, bir antijen üzerindeki belirli bir protein epitopa antikorların bağlanma nedeniyle ve bu nedenle aynı dokuda birden fazla antijene eşzamanlı boyama sağlar. antijenlerin sayısı revealeimmün D floresan ikincil antikor örtüşmeyen spektrumları için olan ihtiyaç ile çapraz reaktivite 17,18 ortadan kaldırmak için, farklı türlerde antikorlarla bağımsız antijenleri hedeflemek için ihtiyaç tarafından sınırlıdır. Bu monte bölümlerde bir veya birden fazla antijenler için immunolabeling tamamlandıktan sonra rapor edilmemiştir ikinci bir antijen için immün, bildiğimiz kadarıyla, etkileşebilir iki ayrı antikorlar ile seri ziyade eş zamanlı etiketleme arkasındaki mantık iken. Burada, daha önce boyanmış ve monte edilmiş bölümlerinin seri immün için bir yöntem tarif eder. detaylardaki kalınlığında kesitler protein / peptid belirteçleri için boyanarak, ardından morfolojisinin geri kazanımı için bir seri immün prosedürü için bu işlemi yaparken, aynı işlemler ince histolojik kesitler de bir standart olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, biocytin ve çıkarmak için işlem ile kaydedilen nöronların doldurmak için pratik bir yaklaşım tarifBizim son çalışma 6,8 sunulduğu gibi kayıtların tamamlanmasından sonra hücreden elektrot, akson ve nöronların dendritik milleri doldurulmasını optimize etmek. Burada anlatılan prosedürün en önemli avantajı kaydedilen hücrenin morfolojisi tamamen iyileşti ve rezeksiyon veya dilimler immunostain çalışmadan önce görüntülü olabilir olmasıdır. Bazı antikorların penetrasyonu ile ilgili sorunlar ikincil immün için rezeksiyon dilimleri gerekli hale olsa da, burada ayrıntılı prosedürler birden fazla bölüm karmaşık nöronlar yeniden ihtiyacını ortadan kaldıracaktır ve yeniden tehlikeye hangi doku kaybı ve diferansiyel büzülmesine bağlı sorunları önleyeceğini geriden kestirmeye et. Bir avantajı süreci immün ve biocytin dolu nöronlar kurtarıldı edildiği dilimleri yeniden kesit sınırlayarak maliyet, zaman, çaba ve pahalı antikorların azaltılması olacaktır. En pratik yönü reklamdırYukarıda belirtilen teknik kullanılarak daha önce kesitler lekeli ay yapılabilir ditional immün. Özellikle, morfoloji kurtarma ölçüde hücrelerden fizyolojik veriler nedeniyle hücre tipi bir temel morfolojik karakterizasyon elde etmek için bir yetersizlik atılır bu potansiyeli azaltacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:203px;">&#160;S7653</td>
			<td style="width:151px;">Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60129</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229806</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guinea pig anti CB1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Af530-1</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse anti CCK</td>
			<td>CURE, UCLA</td>
			<td>courtesy of G. Ohning</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>PV27</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin, Alexa Fluor conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S11227</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibodies</td>
			<td>Invitogen Molecular probes</td>
			<td>Alexa Fluor conjugated dyes</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labnet orbit low speed shaker</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>S-2030-LS</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slide folders</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71520</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome VT 1200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiclamp 700B amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCLAMP 10 Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>pCLAMP 10&#160;</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440 digitizer</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter tips</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-335-100</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microloaders</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers

yama kelepçe tekniğiyle hücreleri elektrofizyolojik kayıtları ateş şekillerine göre, farklı nöronal türlerinin tanımlanması için mümkün hale gelmiştir. Kayıt elektrot biocytin / neurobiotin dahil dendritik arborization ve kaydedilen nöronların akson hedef bölgeleri belirlemek için gerekli olan morfolojik detaylar, post-hoc kurtarma izin verir. Bununla birlikte, farklı bir nörokimyasal kimlikleri ve işlevleri, hücre tipi özel proteinler için immünohistokimyasal boyama ile morfolojik olarak benzer nöronların varlığı göz önüne alındığında kesin nöronlar tespit etmek şarttır. Ağ bağlantısı sağlamak için, fizyolojik kayıtlar için beyin kesitleri 300 um ya da daha büyük bir kalınlıkta hazırlanır. Ancak, bu kalınlık genellikle doku geriden kestirmeye gerektiren nedeniyle antikor penetrasyon ile ilgili sorunlar immünohistolojik postprocessing engellemektedir. dilim rezeksiyon genellikle resul, zorlu bir sanattırdoku ve hücre morfolojisi kaybına ting başka elektroifzyolojik veriler gereksiz verilerin işleme elde edilmiştir. nöronal belirteçlerin seçiminde veri kaybı ve rehber sınırlayacak morfoloji kurtarma yana, ikincil immün tarafından takip ilk hücre morfolojisi kurtarma stratejisini, kabul ettiler. Biz fizyolojik kayıtları ve nörokimyasal kimliğini belirlemek için bölümlerin restaining ardından morfoloji geri kazanılması için daha sonraki seri immün sırasında dolum biocytin için pratik bir yaklaşım getirmektedir. Biz, (PFA) paraformaldehid ile sabitlendi, koyulaştınldı ve kaplandı biocytin ile doldurulmuştur bölümleri ayrılmış ve daha sonra, ikinci bir birincil antikor gün ile tekrar boyanmış olabilir bildirmektedir. Bu restaining lamel kaldırılmasını, bir tampon çözelti içinde bölümlerin yıkama ve nörokimyasal kimlik ortaya çıkarmak için birincil ve ikincil antikorlar kuluçka içerir. yöntem, DAT ortadan kaldırmak için avantajlıdırmorfolojisi kurtarmak için bir yetersizlik nedeniyle ve nörokimyasal belirteçlerinin daraltarak için bir kayıp morfolojiye göre test edilecek.

başarı ile tamamlayan bölümler biocytin dolgu ve immün 2. adımda gerçekleştirilen ve konfokal veya Epifloresans mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir korur. Buna ek olarak, işleme bölümleri de Şekil 2&#39;de gösterilen bölümde 3. adımda takip eden işlemler sırasında etiketli antijen için immün gösterir, kalın bir bölüm (300 um) bir biocytin doldurulmuş nöron morfolojisi streptavidin kullanılarak ortaya çıkarılmıştır kırmızı ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers at JoVE.com

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Bu protokol, biocytin doldurma ve sonraki immünohistokimyasal Postprocess kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları sırasında yamalı nöronların morfolojik geri kazanılması için bir yöntem sunulur. Biz, lekeli ve kaplandı kalınlığında biocytin dolu bölümler, daha sonra ikinci bir birincil antikor gün ya da ay ile tekrar boyanmış edilebileceğini göstermektedir.

Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

The goal of this protocol is to present an efficient method for identifying neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin and immunostaining for recovery of morphology prior to re-staining with specific antibodies to determine neurochemical identity. So this method describes an important step needed to study the diversity in neuronal structure and function. This is essential to understand their role in brain networks.The main advantage of using a sequential processing techniques, is that it eliminates the data loss because of inability to recover morphology. So this helps also guide the neurochemical markers to be tested in these cells. Although this method is described for morphological recovery of cells in thick sections, it can also be applied to thin sections and on previously stained and mounted samples.Generally neutrals new to this method may have difficultly in resealing the soma while detaching from the cell, and may fail to allow adequate time for successful fills. Visual demonstration of this method is critical as specific techniques are required for effective biocytin filling of cells in order to recover the complete morphology. To begin this procedure, in voltage clamp configuration apply small brief voltage steps using the membrane test function in bath mode while approaching the cell.Patch onto the cell by applying suction. Then, hold the cell at negative 70 milivolts. Note the development of a gigaohm seal.Compensate for capacitive transients and then apply controlled suction with a syringe or by mouth to achieve whole cell configuration. Estimate whole cell capacitance and series resistance, and stop the membrane test pulses. Series resistance of less than 10 megaohm is optimal.This will ensure the establishment of whole cell recording conditions to allow for biocytin filling. Upon completion of the physiological recordings, re-establish the patch clamp configuration by slowly moving the recording pipette in small steps, alternating upward and outward in voltage clamp mode. The most critical step in accomplishing morphological recovery of cells, is to ensure the re-sealing of the neuronal soma while detaching the recording pipette from the cell.Using the membrane test function, visualize the loss of capacitive transients and the collapse of current responses to a straight line, which indicates the re-sealing of the cell and the establishment of an outside out patch at the pipette tip. In the meantime, holding the cell at a depolarized potential will facilitate the resealing process. After detaching the pipette from the cell, retain the slice in the recording chamber for three to five minutes to ensure the dye transporting to the distal dendritic and axonal processes.Then, transfer the slice to a 24-well plate containing 4%PFA for fixation. 24 to 48 hours after PFA fixation, transfer all the fixed slices to zero point one molar PBS for storage prior to immunostaining. In this procedure, wash the tissues three times for 10 minutes each in zero point one molar PBS.Next, block the tissues with 10 percent blocking serum for one hour at room temperature. Subsequently, incubate the sections in primary antibodies CB1R at room temperature overnight to identify cannabinoid receptor type 1 expression. Then, wash the brain sections three times for 10 minutes each in 0.1 molar PBS.Streptavidin and secondary antibody to first primary antibody are both added to the well plate and kept overnight at four degrees celsius. Subsequently, incubate the sections in streptavidin red dye conjugate at four degrees celsius overnight in the dark to reveal the biocytin. After that, wash the brain sections three times for 10 minutes each in 0.1 molar PBS.To protect the florescence and to facilitate restaining in the future, mount the sections at an equally spaced mounting medium. Enseal the edges of the cover slips with clear nail polish. In this step, strip the nail polish off of the glass slide with a cotton swab of acetone.Remove the cover slip carefully using fine tip forceps and put a few droplets of 0.1 molar PBS on the sections. It is critical not to damage the process tissue while unmounting the tissue from the aqueous mounting medium. Carefully remove the sections from the slide using a fine paintbrush and wash them in 0.1 molar PBS for 24 to 48 hours on a shaker, and kept away from light in four degrees Celsius.To ensure complete removal of the mounting medium, wash the sections one to two times on the following day in 0.1 molar PBS for 10 minutes each time. Then, incubate the sections with a second primary antibody cholecystokinin for one day. Wash the brain sections three times for 10 minutes each in 0.1 molar PBS.Subsequently, stain the sections with a fluorophore conjugated secondary antibody goat anti-mouse. Making sure that the excitation emission spectra of the secondary antibody do not overlap with streptavidin and prior immunofluorescent stains. Afterward, mount the sections in aqueous mounting medium.Enseal the edges of the cover slip with clear nail polish. Following successful biocytin fill and the first immunostaining process, the neuronal structure can be visualized and imaged as shown in the confocal image obtained at 60x magnification. The section was also immunostained for CB1R along with biocytin, and the CB1R immunostaining in the biocytin expressing neuronal soma is indicated by the arrowhead.The same section was processed for CCK immuno-reactivity after one week, and the image shows successful recovery of CCK immuno labeling in several neurons indicated by the asterisk. Note that the biocytin labeled cell indicated by the arrowhead did not express CCK. A merged image of panels A, B, and C show that all three labels are visualized robustly, and the overlay between biocytin and CB1R is evident.The image shows that the second immunostaining process does not compromise the signal from the prior staining process. Morphology of the biocytin filled cell was obtained from the confocal images prior to this CCK immunostaining. Crucially, in addition to the soma and dendrite, axons can be visualized, and co-labeling of CB1R and biocytin labeled axonal processes is observed.While attempting this procedure, it's important to target healthy cells located below the slice surface to avoid neurons with severed processes. And that could compromise the recover of the morphology. Once mastered, morphological recovery of biocytin filled cells can be reliably obtained during the patch clamp recording.Successful implementation of serial immunostaining technique will improve efficiency of data recovery and facilitate neuronal characterization during standard patch clamp recordings. After watching this video, you should have a good understanding on how to effectively use biocytin filled cells to recover neuronal morphology and to determine neurochemical markers.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Nörobilim

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

Calretinin için Immünostasyon rektal emiş biyopsisi ile Hirschsprung hastalığının tanısı, S100 protein ve protein gen ürün 9,5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...