Name: an optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00
Duration: 8 min 40 s
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The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Pe&#241;a for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

我々が開発したプロトコルは、その後、解糖およびミトコンドリア呼吸性能の違いを評価するために種々の濃度で細胞外フラックス分析に使用した純粋な、生存リンパ球サブセットの効率的な分離を可能にしました。このプロトコルは、リンパ球のために特別に設計されており、このような低い基礎代謝活性、脆弱性、低周波数とこれらの細胞型に関連する特別な考慮事項に対処して、できないことは、アッセイプレートに付着されます。そのため、以前に公開されたプロトコル11,12に比べて、私たちの方法は、免疫学の分野で働く研究者のためのより便利で、より良い最適化されたガイドを提供しています。純粋な、生存細胞集団を得る最適なコンフルエンスで細胞をプレーティングし、各ウェル中のタンパク質濃度に外フラックスアッセイ測定を標準化するなど、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。 私播種した細胞のnitial数は両方の光学顕微鏡により可視化することができ、また、タンパク質濃度の測定を用いて定量します。細胞数及びタンパク質濃度の間の線形相関は、タンパク質濃度が実際に異なるウェル間の細胞数の変化の影響を標準化する方法として使用することができることを確認しました。 タンパク質濃度にECARとOCR結果を標準化することにより、我々は示された、より低い細胞コンフルエンスにもかかわらず、いくつかの5×10 2.5個の細胞/ウェルのデータの品質を損なうことなく、ほとんどのアッセイで使用することができるように。しかし、細胞タイプおよびアッセイ間で変動し使用することができる細胞の下限。例えば、わずか5×10 1.25ような細胞は、B細胞OCR測定のために使用することができるが、さらに2.5×10 5細胞/ウェルを、同じ細胞型の解糖系の性能を評価するのに十分ではなかったです。したがって、限り、細胞数は、制限要因ではないとしてオーバーでメッキ約5×10 5リンパ球に相当する90％のコンフルエンスで、/ウェル、好ましいです。異なるサイズ-、先に活性化され、部分的に分化などの細胞に使用リンパ球を-されたときにさらなる最適化が必要になることがあります。以前に初代培養リンパ球を使用した場合に加え、死亡または瀕死の細胞はまた、測定されたタンパク質レベルに寄与することができるので、細胞数の指標としてのタンパク質濃度の信頼性を減少させる別の処理条件との間の細胞生存率の変化、があるかもしれません。このような場合には、細胞外フラックスアッセイを行う前に、フローサイトメトリーにより生細胞を選別するために役に立つかもしれません。 新たに単離された、高度に実行可能なリンパ球集団を使用して、我々のアッセイでは、我々は両方のOCRとECAR測定のための信頼性の高い機能的なデータを得ました。全ての細胞型は、ミトコンドリアストレス試験において同様に挙動しながら、細胞型間の著しい差がありました解糖負荷試験で観察されました。例えば、ナイーブT細胞の解糖系の性能は、脾細胞またはB細胞と比較して低く、それは、オリゴマイシンの添加によって変化しませんでした。この観察は、我々のプロトコルの有効性を確認し、以前に発表された研究7,30に沿ったものです。 結論として、私たちの方法は、細胞外フラックスアナライザーを用いてリンパ球の代謝活性を試験する効率的かつ便利な方法を提供し、それは代謝活性化の際に、免疫細胞の変化、細胞の分化や原因を探求する免疫学的研究の広い範囲で有用であることができますこのような感染症、自己免疫および血液学的悪性腫瘍などの疾患の表現型に。

抗原に対する免疫応答は、免疫活性化と免疫抑制との間にしっかりと規制のバランスです。免疫抑制は、単にこれらのイベントを阻害し、したがって、不要な免疫応答1-6を防止するのに重要であるのに対し、免疫活性化は、刺激に応答して急速な細胞増殖および遊走、ならびにサイトカイン産生、抗体分泌の増加食作用を駆動します。最近の研究は、直接リンクは、免疫細胞の活性化状態及び様々な代謝経路7の活性の間に存在することを示しています。免疫細胞は、オンとオフのエネルギー産生経路を切り替えることにより、休止および活性化状態の間でシフトすることができます。また、別の免疫細胞タイプの活性化の間に、それらの増加したエネルギー需要を燃料に異なる代謝戦略を使用し得ることが観察されています。例えば、Tリンパ球の活性化はほぼ完全解糖状態8に細胞を指示しながら</su&gt; pは、活性化Bリンパ球は、解糖および酸化的リン酸化9,10のバランスを使用します。これらの研究は、細胞の代謝に対する免疫細胞活性化の影響を調査することの重要性を指摘します。 リアルタイムでは、酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の同時測定は、酸化的リン酸化及び解糖の指標として、経路11から13を製造するエネルギーの状態に対処するための一般的な戦略です。これを達成するために、そのようなシーホースXF 96のような細胞外フラックス分析器は、日常的に使用されます。このような機器は急速に細胞タイプで、または異なる刺激条件にOCRとECARの変化を比較することができます。これまでに、免疫細胞を含む様々な細胞型は、これらのデバイスを使用して研究されています。しかし、特に免疫細胞のために設計され最適化されたプロトコルは使用できません。 免疫細胞、特にリンパ球は、OTとは異なりますいくつかの重要な方法で彼女の細胞型。リンパ球は、ex vivoでの条件14-16で長期間生存していない脆弱な細胞です。これは、例えば、細胞外フラックス解析において使用されるような必須栄養素を欠く次善の増殖培地中で培養しても大きな問題です。マクロファージおよび多くの細胞株とは異なり、リンパ球は、プラスチック表面に付着しません。したがって、ストレスを発生させることなく、分析プレートに添付することが重要です。最後に、いくつかのリンパ球亜集団は非常にまれであってもよく、必要に応じ、最適な量でそれらを収穫することは17-19挑戦的であるかもしれません。 ここでは、具体的には、リンパ球のために開発された最適化されたプロトコルを提供します。 、我々はdifferenにその休止状態の解糖および酸化的リン酸化の特性を示す20ノードマウスの脾臓およびリンパ節から単離した脾臓細胞、Bリンパ球およびナイーブCD4 + Tリンパ球を使用してT細胞密度。データは、細胞数に直接比例した端アッセイ細胞溶解物のタンパク質濃度を測定することにより、各ウェルについての最初の細胞数の違いを説明するために正規化しました。私たちのプロトコルは、細胞外フラックスアッセイのための実行可能なリンパ球の迅速な単離のためのガイドラインを提供するだけでなく、それはまた、データの品質を損なうことなく、次善の細胞濃度での作業を可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">20012-050</td>
			<td style="width:283px;">To make MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin BSA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A3803</td>
			<td style="width:283px;">To make MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.5M EDTA, pH 8</td>
			<td style="width:139px;">Quality Biological</td>
			<td>10128-446</td>
			<td style="width:283px;">To make MACS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">autoMACS rinsing solution</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-091-222</td>
			<td style="width:283px;">Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">11875-093</td>
			<td style="width:283px;">Contains phenol red and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">10437-028</td>
			<td style="width:283px;">For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 &#176;C water bath and then inactivate at 56 &#176;C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 &#176;C until needed.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td style="width:283px;">Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 &#176;C until ready to make media.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">L-Glutamine 200mM (L-Glut)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">25030-081</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10 and stress test media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sodium pyruvate 100mM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">11360-070</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10 and stress test media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">HEPES 1M</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">15630-080</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">11140-050</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2-Mercaptoethanol (55 mM)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-ThermoFisher</td>
			<td style="width:104px;">21985-023</td>
			<td style="width:283px;">Component of RF10</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:139px;">Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:104px;">87712</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip</td>
			<td style="width:139px;">Covidien</td>
			<td style="width:104px;">8881513934</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:104px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Falcon-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:104px;">14-432-22</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">10-548E</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">CellTrics 30 &#956;m cell filter, sterile, single-packed</td>
			<td style="width:139px;">Partec CellTrics</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">B Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-862</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Na&#239;ve CD4+ T cell isolation kit, mouse</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-453</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">LS Column</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td style="width:283px;">Used in cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MidiMACS separator</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td style="width:283px;">Magnet for separation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td style="width:283px;">Holder for magnets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>130-091-222</td>
			<td style="width:283px;">Rinsing solution for autoMACS Pro Separator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">autoMACS Pro Separator Instrument</td>
			<td style="width:139px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Cell-Tak</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">354240</td>
			<td style="width:283px;">Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">75351</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D198501</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A8674</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rotenone</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R8875</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G8270</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">78429</td>
			<td style="width:283px;">Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:104px;">BP-115</td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">23225</td>
			<td style="width:283px;">Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td style="width:139px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:104px;">101085-004</td>
			<td style="width:283px;">Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Seahorse XF Base Medium</td>
			<td style="width:139px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:104px;">102353-100</td>
			<td style="width:283px;">Used to prepare stress test media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:139px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 &#956;m</td>
			<td style="width:139px;">EMD Millipore-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SCGPU10RE</td>
			<td style="width:283px;">Used to sterile filter media.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">487031</td>
			<td style="width:283px;">Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes

リンパ球は、順番に急速な細胞増殖、遊走及び分化、およびサイトカイン産生をもたらす細胞内シグナル伝達経路を活性化することにより、種々の刺激に応答します。これらの事象の全てをしっかり細胞のエネルギー状態にリンクされ、したがって、エネルギー産生経路を研究することは、これらの細胞の全体的な機能に関する手がかりを与えることができます。細胞外フラックス分析器は、多くの細胞型における解糖およびミトコンドリア呼吸の性能を評価するために一般的に使用される装置です。このシステムは、いくつか公表された報告で免疫細胞を研究するために使用されてきた、まだ特にリンパ球用に最適化された包括的なプロトコルが欠けています。リンパ球は、ex vivoでの条件に乏しい生き残る脆弱な細胞です。しばしばリンパ球サブセットはまれであり、かつ低細胞数での作業は避けられません。したがって、これらの困難に対処する実験戦略が必要とされます。ここでは、プロトコルを提供しますそれは、リンパ組織から生存可能なリンパ球の迅速な単離を可能にし、細胞外フラックスアナライザーでそれらの代謝状態の分析のため。さらに、我々は、異なる細胞密度で、いくつかのリンパ球サブタイプの代謝活性を比較した実験の結果を提供します。これらの観察は、我々のプロトコルも低い細胞濃度で一貫性のある、よく標準化された結果を達成するために使用することができ、したがって、それは、免疫細胞における代謝イベントの特性に着目し、将来の研究において広範な用途を有し得ることを示唆しています。

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An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

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