Name: generation of human monocyte-derived dendritic cells from whole blood
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood at JoVE.com

We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies M&#252;hlbacher and Dr. Paul H&#246;rtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم المشاركة من قبل المعهد المركزي لنقل الدم وزارة المناعية، إنسبروك، النمسا: الأخلاقيات بيان. وتمت الموافقة على استخدام عينات بقايا مجهولة الهوية لأغراض علمية من قبل لجنة الأخلاقيات من كلية الطب بجامعة انسبروك. <p class="jove_...

<ol>
	<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Steinman, R. M., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells:+translating+innate+to+adaptive+immunity.">Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).</li><li>Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture,+processing,+and+presentation+by+dendritic+cells:+recent+cell+biological+studies.">Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies.</a> Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).</li><li>Schwarz, J., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Dendritic+Cell+Haptotaxis.">Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis.</a> Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).</li><li>Weber, M., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+chemotactic+dendritic+cell+migration+in+explanted+mouse+ear+preparations.">Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations.</a> Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).</li><li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments.">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).</li><li>Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+promoting+dendritic+cell-mediated+transmission+of+HIV.">Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV.</a> Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).</li><li>Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+HIV-1+infection+in+cutaneous+dendritic+cells+promote+extensive+viral+replication+upon+binding+to+memory+CD4++T+cells.">Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells.</a> J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions.">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li><li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-independent+interaction+of+complement+opsonized+HIV+with+monocyte-derived+dendritic+cells.">C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells.</a> Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).</li><li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+opsonization+of+HIV+impedes+provirus+formation+in+and+infection+of+dendritic+cells+and+subsequent+long-term+transfer+to+T+cells.">IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells.</a> J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).</li><li>Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+control+of+pathogen-driven+T-cell+polarization.">Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.</a> Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).</li><li>Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-dependent+T+cell+activation+in+autoimmunity.">TLR-dependent T cell activation in autoimmunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).</li><li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs.">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).</li><li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+attenuate+the+capacity+of+dendritic+cells+to+stimulate+HIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes.">Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).</li><li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells.">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).</li><li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b/c+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells.">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li><li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules.">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li></ol>

<html> يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (MDDCs) من خلال عزل حيدات الإنسان من الدم المضادة للمتخثر باستخدام الفحص القائمة على جسيمات متناهية الصغر المغناطيسي. في هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ الخطوات الطرد المركزي المنبع الإجراء العزلة الخلية، مم...

الخلايا الجذعية (DCS) هي الخلايا العارضة للمستضد المتخصصة أهم من نظام المناعة لدينا. غير ناضجة البلدان النامية (البلدان الجزرية النامية) يقيمون في الجلد أو في الأنسجة المخاطية وبالتالي هي من بين الخلايا المناعية الأولى للتفاعل مع مسببات الأمراض الغازية. وتمثل البلدان النامية الجسر بين الفطرية ونظام المناعة التكيفية 1، لأنها يمكن أن تفعيل البائية والخلايا الردود التالية الكشف عن العوامل المسببة للأمراض. وعلاوة على ذلك، لأنها تسهم في الاستجابات المناعية الموالية للالتهابات بسبب إفراز كميات عالية من السيتوكينات، مثل IL-1β، IL-6، و IL-12. البلدان النامية أيضا تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية وجذب الخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الإصابة التي كتبها الكيميائي. ويمكن تقسيم البلدان النامية إلى خلايا غير ناضجة شجيري (البلدان الجزرية النامية) والخلايا الجذعية الناضجة (mDCs) 2 بناء على التشكل وظيفة. بعد الاعتراف مستضدات الخارجية من جانب واحد من العديد من مستقبلات التعرف على الأنماط (على سبيل المثال، مثل عدد المستقبلات، C-نوعيكتينس، أو تكمل مستقبلات) أعرب بوفرة على سطح الخلية، البلدان الجزرية النامية تخضع لتغييرات كبيرة وتبدأ في النضج. وخلال هذه العملية النضج، ومستقبلات لالتقاط مستضد وأسفل تنظيم، في حين أن جزيئات أساسية لتقديم المستضد ويصل ينظم 3. ناضجة البلدان النامية يصل تنظيم معقد التوافق النسيجي الكبير الأول والثاني (MHC الأول والثاني)، وشارك في تنشيطية الجزيئات مثل CD80 و CD86، التي تعتبر ضرورية لتقديم المستضد وتنشيط الخلايا اللمفاوية التائية. بالإضافة إلى ذلك، هو فعل للتعبير عن CCR7 مستقبلات chemokine على سطح الخلية، والتي تمكن من الهجرة من البلدان النامية من الأنسجة الطرفية إلى الغدد الليمفاوية. وسهلت الهجرة من قبل &quot;المتداول&quot; من البلدان النامية على طول يجند chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) وchemokine يجند 21 (CCL21 / SLC) التدرج إلى الغدد الليمفاوية 4-6. وبعد الهجرة، mDCs تقديم المستضد تجهيزها لالسذاجة خلايا CD4 + و CD8 + T، وبالتالي رسائل كتبها هذا المؤلفtiating استجابة مناعية التكيف ضد الغازي الممرض 7. ويرتبط هذا التفاعل مع الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية أيضا مع انتشار الفيروس 8. وكشفت الدراسات في المختبر الأخرى التي البلدان النامية التقاط بكفاءة ونقل فيروس نقص المناعة البشرية إلى خلايا T وأن هذه النتائج انتقال الى عدوى نشطة 9-12. هذه التجارب تبرز أن في الجسم الحي فيروس نقص المناعة البشرية يستغل البلدان النامية كما المكوكات من المحيط إلى الغدد الليمفاوية. خلال تقديم المستضد، البلدان النامية تفرز المحفزة الرئيسية التي تحدد شكل التفريق بين المستجيب الخلايا التائية المساعدة، وبالتالي، يتم تحديد نتائج الاستجابة المناعية كلها ضد ميكروب في هذا التفاعل جدا. وبصرف النظر عن نوع 1 (TH1) والنوع 2 (TH2) المستجيب الخلايا التائية، مجموعات فرعية أخرى من الخلايا CD4 + T المساعدة (على سبيل المثال، اكتب 17 (Th17) ونوع 22 (خلايا Th22) T) وقد وصفت، وتحريض و وقد تم التحقيق في وظيفة تماما. وتشارك البلدان النامية علاوة على ذلك فيتوليد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) 13،14. هذه الخلايا هي المثبطة للمناعة، ويمكن أن تتوقف أو أسفل تنظم تحريض أو انتشار المستجيب خلايا تي وحاسمة لتطوير مناعة والتسامح وهكذا. وتضم البلدان النامية التقليدية الإنسان (جان تنمية المجتمعات المحلية) عدة مجموعات فرعية من الخلايا مع الأصل النخاعي (أي خلايا لانغرهانس (خطابات الاعتماد) والجلد والبلدان النامية الخلالي) أو أصل اللمفاوية (أي البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS)). لفي التجارب المختبرية أو استراتيجيات التطعيم العاصمة، وتستخدم البلدان النامية الوحيدات المستمدة بشكل روتيني نموذجا للبلدان النامية عن طريق الجلد. تظهر هذه الخلايا التشابه في علم وظائف الأعضاء، مورفولوجيا، وظيفة الخلايا الجذعية الدم النخاعي التقليدية. يتم إنشاؤها من قبل إضافة انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة بلعم تحفيز مستعمرة عامل (GM-CSF) إلى حيدات معزولة من المتبرعين الأصحاء 12،15-18. ويمكن أيضا أن الخلايا الجذعية تكون معزولة مباشرة من الجلد أو الغشاء المخاطي الخزعات، أو يمكن حتى به وضعت من CD34 + الخلايا الاصلية المكونة للدم المعزولة من عينات دم الحبل السري التي تم الحصول عليها الرحم السابقين. هنا، علينا أن نظهر كيف يتم عزل حيدات وحفز من الدم البشري مكافحة متخثر بعد خلية وحيدة النواة في الدم المحيطي (PBMC) تخصيب بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 5 أيام، وحيدات الإنسان في ظل ظروف محددة هي متباينة في البلدان الجزرية النامية ونحن على استعداد لإجراءات تجريبية في وضع غير سريري.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD19&#160; Clone&#160; HIB19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD83&#160; Clone&#160; HB15e</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Imagnet</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Albumin Fraction V)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EG-Nr 2923225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient media: Ficoll-Paque Premium</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 10mL Serological Pipet</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 25mL Serological Pipet</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3&#160; Clone&#160; HIT3a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)</td>
			<td>Tonbo biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Rotanta 460R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 CC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>C-61401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD14&#160; Clone&#160; M5E2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD209&#160; Clone&#160; DCN46</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human monocyte-derived dendritic cells from whole blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

بعد الطرد المركزي من الدم المضادة للمتخثر باستخدام وسادة السكروز، وإثراء الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) في الطور البيني على أعلى من متوسط كثافة التدرج (الشكل 1). بعد يتم رسمها PBMCs الخروج، يتم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood at JoVE.com

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

The overall goal of this CD14 magnetic beads separation technique is to isolate monocytes from the blood for their further differentiation into dendritic cells or macrophages in vitro. This method can help answer key questions in the field of immunology about the recognition, processing, and presentation of pathogens or antigens by dendritic cells. The main advantage of this isolation procedure is that the 98 to 99%pure monocyte population can be obtained.Demonstrating the procedure will be Karolin Thurnes, a technician from our work group. Begin by splitting the blood pack volume among sterile 50 milliliter centrifuge tubes according to the amount of blood received. Adjust the final volume in each tube to 50 milliliters with sterile Dulbecco's PBS as necessary and centrifuge the samples.Using a sterile one milliliter serological pipette connected to a laboratory vacuum pump, remove the plasma and platelet layers leaving the boundary layers undisturbed. Then, use a new 25 milliliter pipette to combine the mononuclear cell boundary layers from two of the tubes in the new sterile 50 milliliter conical tube. Next, add 15 milliliters of density gradient medium to each of 450 milliliter conical tubes and pipetting slowly and carefully, overlay 25 milliliters of pooled blood cells onto the density gradient in each tube.Separate the cells by centrifugation. Then aspirate the plasma and platelet upper layers and transfer the PBMC interphases into new individual 50 milliliter conical tubes. Wash the PBMCs two times with up to 50 milliliters of sterile DPBS, pulling the cells after the first centrifugation and resuspending the pellet in 50 milliliters of fresh DPBS after the second.After counting, collect the cells by centrifugation for monocyte magnetic particle isolation. To purify the monocytes by magnetic particle isolation, adjust the PBMC concentration to eight times 10 to the 7th cells per milliliter of isolation buffer. Next, vortex the anti-human CD14 magnetic particles thoroughly and mix 50 microliters of particles for every one times 10 to the 7th PBMCs into the cells, and transfer the cell bead solution to a sterile 15 milliliter tube.After 30 minutes at room temperature, adjust the total volume to 12 milliliters of isolation buffer, and transfer two milliliters of the cell particle suspension into each of six sterile round bottom tubes. Immediately place the tubes onto the cell separation magnet for 10 minutes at room temperature. Then remove the supernatant containing the peripheral blood lymphocytes from each tube.Remove the tubes from the magnet and add two milliliters of fresh isolation buffer to each cell sample. Gently pipette up and down to resuspend the cells and particles, and return the tubes to the magnet for another five minutes. At the end of the incubation, remove the supernatant again, and resuspend the cells in two milliliters of fresh isolation buffer as just demonstrated.Then pull the CD14 positive monocyte containing cell fractions into a new 50 milliliter tube and bring the final volume of the tube up to 50 milliliters in sterile DPBS. To differentiate the purified monocytes into dendritic cells, collect the cells by centrifugaiton and resuspend the pellet in 50 milliliters of DPBS. After counting, spin down the cells again and resuspend the pellet at a one times 10 to the 6th cells per milliliter concentration and prewarmed culture medium.Transfer three milliliters of cells into each well of a six well plate and add recombinant human Interleukin four and GMCSF to each well for a 48 hour incubation at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. On the second day of culture, restimulate the cells with fresh cytokines and return the plate to the incubator. On day five, pull the supernatants and gently pipette fresh medium into the wells several times to harvest the immature dendritic cells.After density gradient separation, a typical PBMC fraction is comprised of about 4%B-lymphocytes, 28%monocytes and 68%other cells. 44%of which are t-lymphocytes. After magnetic particle separation, flow cytometric analysis of the negative fraction reveals a similar percentage of b-lymphocytes, a higher percentage of the other cell populations and a greatly reduced percentage of monocytes.Characterization of the positive fraction demonstrates the high purificaiton efficiency with over 99%of the cells expressing CD14. After five days of Interleukin four and GMCSF simulation, the CD14 positive cells differentiate into immature CD83 negative DC-SIGN positive monocyte derived dendritic cells which are comparable to dermal dendritic cells in the morphology, behavior, and receptor expression. Once mastered, this technique can be completed in four to five hours if it is performed properly.After watching this video, you should have a good understading of how to isolate monocytes from whole blood and differentiate them into dendritic cells. This technique is very important for researchers in the field of immunology to explore not only dendritic cell, but also monocyte and macrophage function in the primary in vitro human cell system. Following this procedure, other methods like microscopic analysis, flow cytometry, infection or antigen presentation essays can be performed to answer questions about dendritic cell biology, function and interactions with antigens.Don't forget that working with blood can be hazardous and that precautions such as wearing gloves, a lab coat or having a hepatitis vaccination should always be taken before beginning this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

سيرنا اليكتروبوريشن لتعدل اوتوهاغي في الهربس البسيط الفيروسات نوع 1-الخلايا الجذعية المصابة بالبويضات المشتقة

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

تصور الكاسباز الالتهابي الناجم عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

تحديد مناعة اللقاح باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من وحيدات الأبقار

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...