Name: using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00
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The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. Scaffold Liposome Vorbereitung HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden - sn - glycero-3 - [(N - (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt ...

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	<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor.">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals.">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li><li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission.">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li><li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission.">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li><li>Los&#243;n, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fis1,+Mff,+MiD49,+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission.">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li><li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells.">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li><li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells.">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li><li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission.">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li><li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission.">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li><li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity.">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li><li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basa&#241;ez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1.">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li><li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction.">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li><li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator.">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li><li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Visualization+of+Dynamins.">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li><li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin's+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities.">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li><li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria.">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li><li>Fr&#246;hlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein.">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li><li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hFis1,+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery.">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li><li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1.">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li><li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49/51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li><li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function.">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li><li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins:+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool.">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li><li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule.">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li><li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+helix+dimerization:+Beyond+the+search+for+sequence+motifs.">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li><li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins:+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li><li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li><li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch.">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules.">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine ​​in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. 26 - Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran 24 gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen ...

Studium membran proximal Protein-Protein - Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert 1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag - Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni 2+) Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläche. Unter Verwendung dieser Gerüste, lipid-proximale Protein-Wechselwirkungen können über einen Bereich von Lipid- und Proteinzusammensetzungen untersucht werden. Wir haben effektiv diese Methode angewandt, um die kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer regieren und Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die diese pr modulierenocess 2. Während mitochondrialen Spaltung, eine konservierte Membran - Remodeling - Protein, Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) 3 genannt, wird auf die Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Reaktion auf zelluläre Signale eingestellt , die Energie - Homöostase, apoptotische Signal regulieren, und mehrere andere Integral mitochondrialen Prozesse. 8 - Dieses große wird zytosolische GTPase an die Oberfläche der Mitochondrien durch Wechselwirkungen mit Proteinen integral OMM 4 eingestellt. Die Rolle eines solchen Proteins, Mitochondrial Fission Factor (MFF), ist schwierig gewesen , aufgrund einer scheinbaren schwache Wechselwirkung mit DRP1 in vitro zu untersuchen. Dennoch haben genetische Studien eindeutig gezeigt , dass Mff für eine erfolgreiche mitochondrialen Spaltung 7,8 wesentlich ist. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben konnte früheren Mängel zu überwinden, indem die gleichzeitige Lipid-Wechselwirkungen, die Einführung von DRP1-Mff Wechselwirkungen fördern. Insgesamt ist dieses neuen Assay REVEAführte fundamentalen Wechselwirkungen der Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer Führung und eine neue Etappe für die laufende strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser wesentlichen molekularen Maschine zur Verfügung gestellt. Bislang Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DRP1 und Mff haben durch die inhärente Flexibilität der Mff 9, die Heterogenität der DRP1 Polymeren 2,10, und die Schwierigkeit bei der Reinigung und Rekonstitution von voller Länge Mff mit einer intakten Transmembran- Domäne 11 kompliziert. Wir adressiert diese Herausforderungen mithilfe von NTA (Ni 2+) Gerüst Liposomen His-markierte Mff fehlt seine Transmembran - Domäne (MffΔTM-His 6) zu rekonstruieren. Diese Strategie war vorteilhaft , da MffΔTM extrem gut löslich war , als überexprimiert in E. coli, und das isolierte Protein wurde auf Gerüst Liposomen leicht wiederhergestellt. Wenn auf diese Lipid templates gebunden, angenommen Mff eine identische, nach außen weisende Orientierung an der Oberfläche der Membran.Zusätzlich zu diesen Vorteilen wurden mitochondrialen Lipiden, wie Cardiolipin, hinzugefügt Mff Faltung und Assoziation mit der Membran 11 zu stabilisieren. Cardiolipin interagiert auch mit der variablen Domäne der DRP1 2,12 welche diese ungeordneten Bereich stabilisieren kann und die Montage der Spaltmaschinen erleichtern. Diese robuste Methode ist allgemein anwendbar für zukünftige Studien, die Membran-proximalen Protein-Wechselwirkungen zu bewerten suchen. Durch den Einsatz von zusätzlichen Anbinden / affine Wechselwirkungen kann die Komplexität dieser Membran Rekonstitution Untersuchungen verbessert werden zusätzliche Komplexität an der Oberfläche der Membranen in Zellen zu imitieren. Zur gleichen Zeit, Lipidzusammensetzungen können modifiziert werden, um mehr, um genau die nativen Umgebungen dieser makromolekularen Komplexen nachahmen. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren ein Mittel, um die relativen Beiträge von Proteinen und Lipiden in der Gestaltung Membranmorphologien bei kritischen zellulären proc zu untersuchenzesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850375</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:287px;">DGS-NTA(Ni2+)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">840012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Chloroform</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">268320010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Liposome Extruder</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cu/Rh Negative Stain Grids</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:136px;">79712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microfuge Tube</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;">357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GTP</td>
			<td style="width:229px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">NU-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GMP-PCP</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M3509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microtiter Plate strips</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">469949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">40993-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Instant Blue Coomassie Dye</td>
			<td style="width:229px;">Expedeon</td>
			<td style="width:136px;">ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HEPES</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">BME</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KOH</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4-20% SDS-PAGE Gel</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">456-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4x Laemmli Loading Dye</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Malachite Green Carbinol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">229105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Laboratory Film</td>
			<td style="width:229px;">Parafilm</td>
			<td style="width:136px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:229px;">Polysciences</td>
			<td style="width:136px;">21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tecnai T12 100 keV Microscope</td>
			<td style="width:229px;">FEI</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Optima MAX</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">TLA-55 Rotor</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Refrigerated CentriVap Concentrator</td>
			<td style="width:229px;">Labconico</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td style="width:229px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">VersaMax Microplate reader</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ​​in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni 2+ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni 2+)) für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein - Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.

Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni 2+) Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst a...

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...