Name: using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. הכנת Liposome פיגום הערה: באופן אידיאלי, ניסויים ראשוניים צריכות להשתמש פיגום פשוט חסר ייחוד יחסית (מורכב dOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine או PC) DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) (1,2-dioleoyl - SN -glycero-3 - [(N - (5-אמינו-1-carboxypentyl) חומצת iminodiacetic) succinyl]. (מל?...

<ol>
	<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor.">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals.">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li><li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission.">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li><li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission.">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li><li>Los&#243;n, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fis1,+Mff,+MiD49,+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission.">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li><li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells.">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li><li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells.">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li><li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission.">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li><li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission.">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li><li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity.">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li><li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basa&#241;ez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1.">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li><li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction.">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li><li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator.">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li><li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Visualization+of+Dynamins.">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li><li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin's+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities.">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li><li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria.">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li><li>Fr&#246;hlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein.">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li><li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hFis1,+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery.">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li><li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1.">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li><li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49/51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li><li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function.">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li><li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins:+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool.">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li><li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule.">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li><li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+helix+dimerization:+Beyond+the+search+for+sequence+motifs.">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li><li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins:+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li><li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li><li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch.">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules.">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li></ol>

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקירת אינטראקציות בין חלבונים מעורבים חלבונים בממברנה נפרד. על ידי ניצול פיגום ליפוזום מודולרי, חוקרים מסוגלים להעריך את הפעילות של חלבונים אחד או יותר בסביבת שומנים הפרוקסימלי. מחקרים קודמים הוכיחו בשיטה דומה עבור אנזימי קולטן של קרום הפלזמ?...

לימוד אינטראקציות קרום הפרוקסימלי חלבונים הוא מאמץ מאתגר בשל קושי משחזר את הסביבה הטבעית של חלבונים בממברנה נפרדים המעורבים 1. זאת בשל הצורך של solubilization דטרגנט ואת הכיוון הלא סדירה של חלבונים proteoliposomes. על מנת למנוע בעיות אלה, יש לנו עובדים אסטרטגיה לפיה תחומים מסיסים של חלבונים בממברנה נפרדים מבוטאות חלבוני היתוך התג שלו, ושברי מסיסים אלה מעוגנים ליפוזומים פיגום באמצעות אינטראקציות עם נת&quot;ע (Ni 2 +) headgroups על השומנים משטח. באמצעות פיגומים אלה, אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי שומנים יכולות להיחקר על פני טווח של קומפוזיציות שומנים וחלבונים. יש לנו ליישם ביעילות בשיטה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבונים הקריטיים השולטים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה ולבחון אינטראקציות שומנים לווסת pr זהocess 2. במהלך ביקוע המיטוכונדריה, חלבון שיפוץ קרום משומר, שנקרא הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) 3, מגויסת אל פני השטח של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (OMM) בתגובה לאותות הסלולר המווסתים הומאוסטזיס אנרגיה, איתות אפופטוטיים, וכמה אחרים תהליכי המיטוכונדריה נפרדים. GTPase גדול, cytosolic זה גייס אל פני השטח של המיטוכונדריה דרך אינטראקציות עם חלבונים OMM אינטגרלי 4 - 8. תפקידו של חלבון אחד כזה, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), כבר קשה להבהיר עקב אינטראקציה חלשה לכאורה עם Drp1 במבחנה. אף על פי כן, מחקרים גנטיים הראו בבירור כי MFF חיונית 7,8 ביקוע המיטוכונדריה מוצלח. השיטה המתוארת בכתב היד הזה הייתה מסוגלת להתגבר על חסרונות קודמים על ידי החדרת אינטראקציות שומנים סימולטני המקדמות אינטראקציות Drp1-MFF. בסך הכל, revea assay הרומן הזההובל כוחות יסוד המנחים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה וספק שלב חדש ללימודי מבניים ותפקודיים מתמשכים של מכונה מולקולרית חיונית זה. נכון להיום, בחינת יחסי הגומלין בין Drp1 ו MFF כבר מסובך בגלל הגמישות המובנית של MFF 9, ההטרוגניות של Drp1 פולימרים 2,10, והקושי מטהרים reconstituting באורך מלא MFF עם תחום הטרנסממברני שלם 11. טיפלנו אתגרים אלה באמצעות נ.ת.ע (Ni 2 +) ליפוזומים פיגום כדי לשקם MFF מתויג שלו חסר תחום הטרנסממברני שלה (MffΔTM-שלו 6). אסטרטגיה זו הייתה יתרון משום MffΔTM היה מסיס מאוד כאשר ביטוי יתר ב E. coli, וחלבון מבודד זה היה מחדש בקלות על ליפוזומים הפיגום. כאשר קשור לתבניות השומנים האלה, MFF להניח אוריינטציה זהה, פונים כלפי חוץ על פני הממברנה.בנוסף יתרונות אלה, שומנים המיטוכונדריה, כגון cardiolipin, נוספו לייצב מתקפלים וההתאגדות MFF עם קרום 11. Cardiolipin גם אינטראקציה עם התחום המשתנה של Drp1 2,12 אשר עשוי לייצב באזור המופרע הזה ולהקל הרכבה של מכונות הביקוע. שיטה חזקה זו ישימה נרחב למחקרים עתידיים המבקשים להעריך אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי הממברנה. באמצעות שימוש אינטראקציות קשירה / זיקה נוספות, התחכום של מחקרי כינון מחדש קרום אלה ניתן לשפר כדי לחקות מורכבות נוספת נמצאת על פני השטח של ממברנות בתוך תאים. במקביל, קומפוזיציות שומנים ניתן לשנות באופן מדויק יותר לחקות את סביבות יליד מתחמי macromolecular אלה. לסיכום, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת התרומה היחסית של חלבונים ושומנים בעיצוב מורפולוגיות הממברנה במהלך proc הסלולר הקריטיesses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850375</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:287px;">DGS-NTA(Ni2+)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">840012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Chloroform</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">268320010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Liposome Extruder</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cu/Rh Negative Stain Grids</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:136px;">79712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microfuge Tube</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;">357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GTP</td>
			<td style="width:229px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">NU-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GMP-PCP</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M3509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microtiter Plate strips</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">469949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">40993-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Instant Blue Coomassie Dye</td>
			<td style="width:229px;">Expedeon</td>
			<td style="width:136px;">ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HEPES</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">BME</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KOH</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4-20% SDS-PAGE Gel</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">456-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4x Laemmli Loading Dye</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Malachite Green Carbinol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">229105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Laboratory Film</td>
			<td style="width:229px;">Parafilm</td>
			<td style="width:136px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:229px;">Polysciences</td>
			<td style="width:136px;">21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tecnai T12 100 keV Microscope</td>
			<td style="width:229px;">FEI</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Optima MAX</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">TLA-55 Rotor</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Refrigerated CentriVap Concentrator</td>
			<td style="width:229px;">Labconico</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td style="width:229px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">VersaMax Microplate reader</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

מחקרים של חלבונים בממברנה נפרדים במבחנה מסובך לעתים קרובות על ידי הנוכחות של תחום הטרנסממברני הידרופובי. שמסבך עוד יותר את המחקרים הללו, reincorporation של חלבונים בממברנה דטרגנט-solubilized לתוך ליפוזומים הוא תהליך סטוכסטיים שבו טופולוגיה חלבון אי אפשר לאכוף. מאמר זה מציע שיטה חלופית לטכניקות מאתגרות אלו אשר מנצלות פיגום מבוסס liposome. מסיסות חלבון מוגברת על ידי מחיקה של תחום הטרנסממברני, וחומצות אמינו אלה מוחלפים עם מחצית קשירה, כגון תג שלו. לקשור זה אינטראקציה עם קבוצת עיגון (Ni 2 + מתואם על ידי חומצה nitrilotriacetic (נ.ת.ע (Ni 2 +)) עבור חלבונים שלו מתוייגים), אשר כופה טופולוגיה חלבון אחידה על פני השטח של liposome. דוגמה מוצגת שבה האינטראקציה בין הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) עם חלבון ממברנלי אינטגרלי, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), היה investigated בשיטה ליפוזום פיגום זה. בעבודה זו, אנו הדגמנו את היכולת של MFF לגייס מסיסי Drp1 ביעילות אל פני השטח של ליפוזומים, אשר עורר פעילות GTPase שלה. יתר על כן, Drp1 הצליח tubulate תבנית השומנים המעוטר MFF בנוכחות שומנים ספציפיים. דוגמא זו ממחישה את האפקטיביות של ליפוזומים פיגום באמצעות מבחנים מבניים ותפקודיים ומדגישה את תפקיד MFF בהסדרת פעילות Drp1.

<html> בעוד האינטראקציה בין Drp1 ו MFF הודגמה להיות חשוב לביקוע המיטוכונדריה, אינטראקציה זו כבר קשה לשחזר במבחנה. מטרתנו הייתה לחקות את הסביבה התאית טוב יותר שבו Drp1 ו MFF אינטראקציה. לשם כך, ליפוזומים המכילים ריכוזים הגבלת נת&quot;ע (Ni 2 +) headgroups הוכנו ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro at JoVE.com

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

The overall goal of this technique is to capture lipid-proximal protein-protein interactions in vitro. This method can help answer questions in the mitochondrial dynamics field, such as how protein-protein interactions at the mitochondrial outer membrane can be affected by accessory lipids. The main advantage of this technique is that tethering soluble protein domains to lipid templates ensures that a more native confirmation can be achieved.Moreover, complex interactions between soluble proteins and their tethered partners can be assessed in the presence of defined lipid cofactors. Though we use this method to investigate protein interactions in the mitochondrial fission machinery, it can also be applied to other protein complexes that localize to diverse membrane compartments. Demonstrating this procedure will be Ryan, a grad student from my laboratory.First, combine chloroform solutions of the desired lipids in a clean glass test tube. Evaporate the solvent with dry nitrogen gas while rotating the tube to form a thin lipid film. Then remove the residual solvent with the centrifugal evaporator for one hour at 37 degrees Celsius.Following this, add pre-heated buffer A to give a final lipid concentration of one to two millimolar. Incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius with occasional vortexing to fully resuspend the lipid mixture. After incubation, transfer the lipid mixture to a plastic test tube and place the tube in liquid nitrogen for approximately 30 seconds until completely frozen.Then place the tube in a 37 degree Celsius waterbath for one to two minutes until fully thawed. Next prepare a lipid extruder by soaking four filter supports and a polycarbonate filter in buffer A and assembling the extruder according to the manufacturer's instructions. Extrude the lipid solution through the filter 21 times using gentle constant pressure to ensure a homogenous size distribution.While extruding, use slow constant pressure to ensure liposome size homogeneity. With a one micron filter, this is less important. But with smaller filter sizes, can introduce more apparent heterogeneity.Store the extruded liposomes at four degrees Celsius. Incubate His-tagged mitochondrial fission factor or Mff with scaffold liposomes for at least 15 minutes at room temperature in buffer A and BME. For an Mff-free control, incubate the liposomes with a His-tagged control protein, such as GFP, to bind and shield exposed Nickel-NTA.Add dynamin-related protein one or Drp1 to the liposome mixture and incubate for one hour at room temperature. Next, transfer five microliters of the sample to a sheet of laboratory film and lay a carbon-coated copper-rhodium grid on top of the sample. After incubating for one minute, remove the excess liquid with filter paper and add a drop of 2%uranyl acetate.After incubating for another minute, remove the excess stain with filter paper, and transfer the sample to a grid box. On the following day, image the samples using a transmission electron microscope at the 18, 500 to 30, 000X magnification to observe ultrastructural changes in protein and liposome morphologies. Incubate His-tagged Mff and Fis1 with the scaffold liposomes for 15 minutes at room temperature in buffer A and BME.Add Drp1 and incubate each mixture for an additional 15 minutes at room temperature. Transfer the tubes to the thermocycler set to 37 degrees Celsius and initiate the reactions by adding GTP and magnesium chloride. At the desired time points, transfer 20 microliters of each reaction mixture to wells of a microtiter plate containing five microliters of 0.5 molar EDTA to chelate the magnesium and stop the reaction.Following this, prepare a set of phosphate standards by diluting potassium phosphate in buffer A and BME to calibrate the results. Add 20 microliters of each standard to the wells containing five microliters of 0.5 molar EDTA. Add 150 microliters of malachite green reagent to each well.Finally, read the OD 650 five minutes after each addition. GTP will hydrolyze slowly in the presence of the acidic malachite green reagent. So this reagent should be added to all sample wells within 10 minutes of measuring the absorbance to maximize signal to noise.In the absence in Drp1, neither Mff nor GFP resulted in membrane deformation. And only featureless liposomes were observed for GFP-decorated enriched scaffold liposomes or ESL. However, when Drp1 was added to Mff-decorated ESL templates remodeling of the liposomes was evident.Decoration of the SL with Mff enhanced GTPase activity. Conversely, when the exposed NTA head groups were blocked with His-tagged GFP, this augmented GTPase activity was ablated. Tethering of Fis1 lacking its transmembrane domain to the SL, also failed to elicit a stimulation of Drp1's GTPase activity.Similar to the SL, addition of SL/Cl to Drp1 resulted in a slight stimulation of GTPase activity that was reversed by tethering His-tagged Fis1 or GFP to the liposomes. A synergy between Mff and cardiolipin was observed as the GTPase activity of Drp1 was stimulated 2.6-fold when it was incubated with Mff-decorated SL/CL. When SL/PE/CL templates were decorated with Mff, Drp1 activity was enhanced.The ability of Drp1 to remodel liposomes into lipid tubules was enhanced by the addition of PE to the scaffold liposomes. Once mastered, these scaffolds can be prepared and used in hours if the procedure is performed properly. Following this procedure, other protein and lipid interaction methods like sedimentation and light-scattering assays can be performed in order to characterize functional interactions.The application of this technique allows people examining protein translocation to a defined biological membrane to explore transient protein interactions and the impact of specific lipid cofactors in the formation and stabilization of essential cellular assemblies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...