Name: the chip-exo method: identifying protein-dna interactions with near base pair precision
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision at JoVE.com

We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.

नोट: डबल आसुत एच 2 ओ या आणविक ग्रेड बराबर सभी buffers और प्रतिक्रियाओं घोला जा सकता है के लिए सिफारिश की है। 0 दिवस: सामग्री तैयार करना और सेल हार्वेस्ट 1. बफर तैयारी <ol><li> 3 (टेबल्स - 1 - 3)</...

<ol>
	<li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+eukaryotic+genes+are+transcribed.">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling.">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli.">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li><li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF/cohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer.">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li><li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination.">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li><li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+(-SirA)+Signal+Transduction+Systems.">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035 (2015).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome.">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li><li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes.">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339 (2016).</li><li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework.">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).</li><li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution.">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MACE:+model+based+analysis+of+ChIP-exo.">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).</li><li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy.">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).</li><li>Landt, S. 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<html> हम एक कार्यात्मक जीनोमिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत क्रोमेटिन के पास आधार जोड़ी के प्रस्ताव पर एक निष्पक्ष, जीनोम चौड़ा तरीके से प्रोटीन बातचीत के लिए सटीक बाध्यकारी स्थान निर्धारित करने के लिए। पास आधार...

Chromatin immunoprecipitation (चिप) चुनिंदा डीएनए टुकड़े कि जीवित कोशिकाओं में एक भी प्रोटीन के साथ बातचीत के लिए समृद्ध जीन विनियमन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। चिप समृद्ध डीएनए टुकड़े के तरीकों का पता लगाने के रूप में विकसित किया है प्रौद्योगिकी उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) 1 के लिए oligonucleotide प्रोटीन (चिप चिप) पर संकरण के लिए एक एकल ठिकाना (मानक चिप qPCR) का पता लगाने से बेहतर बनाता है। हालांकि चिप seq बड़े पैमाने पर आवेदन, क्रोमेटिन विविधता और अविशिष्ट डीएनए बातचीत देखा गया है डेटा की गुणवत्ता झूठी सकारात्मक और imprecise मानचित्रण के लिए अग्रणी बाधा है। इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए, डॉ फ्रैंक प्यूघ चिप EXO विधि 2 विकसित की है। चिप EXO की मुख्य विशेषता यह है कि यह exonuclease &#39;3&#39; के लिए एक 5 को शामिल किया गया है, प्रभावी ढंग प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी स्थानों footprinting है। नतीजतन, चिप EXO कार्यप्रणाली उच्च संकल्प, detectio का अधिक से अधिक गतिशील रेंज को प्राप्त होता हैएन, और कम पृष्ठभूमि शोर। हालांकि चिप EXO अधिक तकनीकी रूप से चिप seq से गुरु को चुनौती दे रहा है, यह व्यापक रूप के रूप में अध्ययन विविध जैविक प्रणालियों का उपयोग कर 3-8 अद्वितीय अल्ट्रा उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए लक्ष्य को अपनाया जा रहा है। दरअसल, चिप EXO सफलतापूर्वक बैक्टीरिया, खमीर, माउस, चूहा, और मानव सेल प्रणाली को लागू किया गया है। सिद्धांत के सबूत के रूप में, चिप EXO मूल रूप से खमीर प्रतिलेखन के एक मुट्ठी कारक 2 के लिए सटीक बाध्यकारी मूल भाव की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। तकनीक को भी प्रतिलेखन पूर्व दीक्षा परिसर के संगठन अध्ययन करने के लिए, और विभिन्न histones 9,10 के subnucleosomal संरचना समझने के लिए खमीर में इस्तेमाल किया गया था। हाल ही में, हम आसन्न TFIIB और पोल द्वितीय बाध्यकारी मानव प्रमोटरों पर घटनाओं को हल करने चिप EXO leveraged, और पता चला है कि बड़े पैमाने पर अलग-अलग प्रतिलेखन उठता से अलग दीक्षा परिसरों 11। यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह अनुकूलित और हैस्तनधारी चिप EXO (चित्रा 1) के लिए treamlined। सबसे पहले, रहने वाले प्राथमिक या टिशू कल्चर कोशिकाओं को एक सहसंयोजक crosslink के माध्यम से विवो प्रोटीन डीएनए बातचीत में संरक्षित करने के लिए formaldehyde के साथ व्यवहार कर रहे हैं। कोशिकाओं lysed रहे हैं और क्रोमेटिन ~ 100 के लिए sheared - 500 आधार जोड़ी आकार के टुकड़े। चिप तो चुनिंदा ब्याज की प्रोटीन के लिए crosslinked डीएनए टुकड़े के लिए समृद्ध करती। इस बिंदु पर, चिप seq पुस्तकालयों आम तौर पर तैयार किया जाता है, जो स्वाभाविक कुछ सौ आधार जोड़े की औसत टुकड़ा आकार का पता लगाने के प्रस्ताव को सीमित करता है। हालांकि, चिप EXO छोड़ दिया और लैम्ब्डा exonuclease के साथ प्रोटीन डीएनए Crosslink साइट के अधिकार 5 &#39;डीएनए सीमाओं trimming द्वारा इस सीमा पर काबू। अनुक्रमण पुस्तकालयों तो exonuclease पचा डीएनए से निर्माण कर रहे हैं, जैसा कि नीचे विस्तृत जानकारी दी। जिसके परिणामस्वरूप नेस्ट 5 &#39;सीमाओं प्रोटीन डीएनए बातचीत (चित्रा 1, चरण 14) की एक में विवो पदचिह्न का प्रतिनिधित्व करते हैं, और उच्च throughput अनुक्रमण से पता चला रहे हैं। AltHough चिप EXO कार्यप्रणाली चिप seq से शामिल है, सबसे कदम के बीच संक्रमण सरल मनका धोने, जो नमूना नुकसान और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करता है की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण बात है, के बाद से चिप EXO चिप seq, किसी भी नमूने चिप seq के साथ सफल हुआ है कि यह भी चिप EXO के साथ सफल होना चाहिए का एक परिष्कृत संस्करण है। चिप seq से एक मौलिक अलग डेटा संरचना में चिप EXO परिणामों के साथ प्रोटीन डीएनए बातचीत के vivo footprinting। आम चिप seq कॉलर्स सबसे सटीक शिखर कॉल प्राप्त करने के लिए चिप EXO डेटा को लागू किया जा सकता है, हम जैव सूचना विज्ञान उपकरण विशेष रूप से ध्यान में चिप EXO डेटा की अनोखी संरचना के साथ डिजाइन सलाह देते हैं। ये Genetrack, मणि, गदा, Peakzilla, और ExoProfiler 12-15 शामिल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >28908</td>
			<td >Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI)</td>
			<td >Roche Life Science</td>
			<td >11873580001</td>
			<td >Sections 4, 8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bioruptor sonicator</td>
			<td >Diagenode</td>
			<td >UCD200</td>
			<td >Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml polystyrene tubes</td>
			<td >BD Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MagSepharose Protein G Xtra beads</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-9670-66</td>
			<td >Section 6</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >12321D</td>
			<td >Sections 6-17, 22</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Tube Rotator</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >05-450-127</td>
			<td >Sections 7, 22</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 DNA Polymerase</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0203</td>
			<td >Section 9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA Polymerase I, Klenow</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0210</td>
			<td >Section 9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2)</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >B7002</td>
			<td >Sections 9-11, 13, 15, 20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer C</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5382</td>
			<td >Sections 9-16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td >Roche Life Science</td>
			<td >010419979001</td>
			<td >Sections 9, 11, 13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTPs</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >N0447</td>
			<td >Sections 9, 12, 19, 23</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0201</td>
			<td >Sections 9, 13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >N0440</td>
			<td >Sections 10, 20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Klenow 3&#39;-5&#39; Exo Minus</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0212</td>
			<td >Sections 10, 20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0202</td>
			<td >Sections 11, 21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#934;-29 DNA Polymerase</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0269</td>
			<td >Sections 12, 19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10x &#934;-29 Buffer</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >B0269</td>
			<td >Sections 12, 19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lambda Exonuclease</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0262</td>
			<td >Section 14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10x Lambda Buffer</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >B0262</td>
			<td >Section 14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RecJf Exonuclease</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0264</td>
			<td >Section 15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K</td>
			<td >Roche Life Science</td>
			<td >03115828001</td>
			<td >Section 16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen</td>
			<td >Roche Life Science</td>
			<td >010901393001</td>
			<td >Section 18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10x T4 Ligase Buffer</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >B0202</td>
			<td >Section 21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMPure XP (clean up) beads&#160;</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >A63881</td>
			<td >Section 22</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Q5 Hot Start DNA Polymerase&#160;</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >M0493</td>
			<td >Section 23</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)</td>
			<td >New England BioLabs</td>
			<td >B9027</td>
			<td >Section 23</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qubit Fluorometer</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >Q33216</td>
			<td >Section 25</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >28704</td>
			<td >Section 25</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optical Clear Qubit tubes&#160;</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >Q32856</td>
			<td >Section 26</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >Q32851</td>
			<td >Section 26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the chip-exo method: identifying protein-dna interactions with near base pair precision

Chromatin immunoprecipitation (चिप) एपिजेनेटिक्स जीन और विनियमन कि विशिष्ट प्रोटीन डीएनए बातचीत को अलग कर के क्षेत्र में एक अनिवार्य उपकरण है। उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के लिए मिलकर चिप सामान्यतः प्रोटीन है कि क्रोमेटिन के साथ बातचीत के जीनोमिक स्थान निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, चिप seq कई सौ आधार जोड़े की अपेक्षाकृत कम मानचित्रण संकल्प और उच्च पृष्ठभूमि संकेत आड़े आती है। चिप EXO तरीका है कि काफी हद तक दोनों संकल्प और शोर पर सुधार चिप seq के एक परिष्कृत संस्करण है। चिप EXO कार्यप्रणाली के प्रमुख गौरव पुस्तकालय तैयारी कार्यप्रवाह को प्रभावी ढंग से बाईं पदचिह्न में लैम्ब्डा exonuclease पाचन के समावेश और सही 5 प्रोटीन डीएनए Crosslink साइट के &#39;डीएनए सीमाओं है। चिप EXO पुस्तकालयों तो उच्च throughput अनुक्रमण के अधीन हैं। परिणामी डेटा कार्यात्मक संगठन ओ में अद्वितीय और अल्ट्रा उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोग किया जा सकताजीनोम च। यहाँ, हम चिप EXO तरीका है कि हम अनुकूलित और स्तनधारी प्रणालियों और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण-से-संश्लेषण मंच के लिए सुव्यवस्थित किया वर्णन है।

निम्नलिखित आंकड़े चिप EXO यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल से प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं। कुछ enzymatic कदम के साथ परंपरागत चिप seq के तरीके के विपरीत, चिप EXO ग्यारह क्रमिक रूप से निर्भर एंजाइमी प्रतिक्रि...

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The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

चिप EXO विधि: निकट आधार जोड़ी प्रेसिजन साथ प्रोटीन डीएनए सहभागिता की पहचान

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

The overall goal of this functional genomic technology is to identify the precise genomic locations that a given protein occupies in living cells. This method can help answer key questions in the fields of gene regulation and epigenetics such as how the transcription machinery assembles and operates in the context of chromatin. The main advantage of this technique is it reveals the exact genomic location for protein DNA interactions at near-base pre-resolution with exceptionally low background.Generally, individuals new to this method will struggle because the protocol is complex and requires attention to detail throughout. To sonicate nuclear lysates, begin by placing resin adapters in 15 milliliter polystyrene tubes containing nuclear extracts. Sonicate the lysates in an ice cold water bath at medium power for 30 seconds on and 30 seconds off for a total of two 15-minute sessions.To check sonication results, transfer two 10 microliter samples from each tube into 1.5 milliliter tubes. Then reverse crosslinks by combining the first 10 microliter sample with 10 microliters of TE-RNase A and 0.2 microliters of proteinase K.Incubate the tube at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Then add four microliters of 6X xylene DNA dye.To the second 10 microliter sample, preserve crosslinks by adding two microliters of 6X xylene DNA dye. Run both samples on a 1.5%agarose gel at 140 volts for approximately 30 to 45 minutes until the bromophenol dye in the latter is three-quarters of the way down the gel. If sonication was successful, transfer sonicated lysates to two milliliter tubes containing 150 microliters of 10%Triton X-100 and vortex to mix.Pellet the insoluble chromatin and debris by spinning the sonicated lysates at 20, 000 times g at four degrees Celsius for 10 minutes. Then transfer the supernatants to new two milliliter tubes. Store the samples at negative 80 degrees Celsius indefinitely.For each chromatin immunoprecipitation or ChIP reaction, combine 1.5 milliliters of sonicated extracts with antibody bead conjugates in 1.5 milliliter tubes. Incubate the tubes on a mini tube rotator at a speed of nine at four degrees Celsius overnight. Check after a few minutes to ensure samples are not leaking and are mixing properly.The following day, very briefly spin down the tubes to collect the liquid in the caps and place the tubes on a magnetic rack for one minute. Then aspirate the extract. Add 0.75 milliliters of RIPA buffer to each tube.Then remove the tubes from the magnetic rack and invert them several times to mix. After a brief spin, place the tubes back on the magnet and aspirate the supernatant. Following the last wash, add 0.75 milliliters of 10 millimolar Tris HCL to each tube.Remove the tubes from the magnetic rack and invert the samples several times to mix. After a brief spin, place the tubes back on the rack and aspirate the supernatant. After carrying out the polishing and detailing reactions according to the text protocol, fill out the ligation master mix calculations.Then make the ligation mix in a 1.5 milliliter tube on ice and pipette to mix the solution. With the sample tubes on the magnetic rack, add 48 microliters of P7 ligation master mix and two microliters of a different adapter index to each of the sample resins. Incubate the samples in a ThermoMixer at three times g in 25 degrees Celsius for two hours.After washing the samples and performing the Phy 29 nick repair and kinase reactions according to the text protocol, fill out the lambda exonuclease master mix calculations and make the lambda exonuclease mix in a 1.5 milliliter tube on ice. Add 50 microliters of lambda exonuclease mix to each sample resin while still on the magnetic rack. Then incubate the samples in a ThermoMixer at three times g in 37 degrees Celsius for 30 minutes.After aspirating the last wash as described in the text protocol, carry out RecJf nuclease reaction by filling out the RecJf master mix calculations and making the RecJf mix on ice. Add 50 microliters of the RecJf mix to each sample resin on the magnetic rack. Then incubate the samples in a ThermoMixer at three times g in 37 degrees Celsius for 30 minutes.After aspirating the last wash, prepare the ChIP elution buffer and proteinase K master mix and add 200 microliters of the solution to each sample resin. Incubate the samples in a ThermoMixer at three times g in 65 degrees Celsius overnight with a heated lid to prevent condensation. The following day, briefly spin the samples and place the tubes on the magnetic rack for one minute.Then transfer 200 microliters of supernatant to a new 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of TE buffer. Following DNA extraction, P7 primary extension and ATL reactions, fill out the P5 adapter ligation table master mix calculations and make the ligation master mix on ice. Add 20 microliters of the ligation mix to each sample and pipette to mix.Then incubate the samples in a thermal cycler at 25 degrees Celsius for two hours. Carry out DNA purification and quantification according to the text protocol. As shown here, it is worth spending time to optimize sonication conditions to obtain high-quality chromatin extracts that yield DNA fragments between 100 to 500 base pairs.And electrophoretic mobility shift assay is used to verify that the sonicated extracts contain intact protein DNA crosslinks, evident as a super shift of DNA fragments. To assess background signal, a mock ChIP is routinely performed without antibody in the reaction. A high-quality ChIP exo-library will yield very little background in the mock sample compared to a ChIP-seq library preparation.Shown here is a bioanalyzer assessment of a ChIP-exo library. Analysis accurately ensures the library size distribution and detects contaminating adapter dimers that run at 125 base pairs. This panel illustrates the smooth distribution of strand-separated ChIP-exo tag five prime Ns for polymerase II, TFIIB and TBP at the human RPS12 gene in proliferating K562 cells.Shown in this figure are average ChIP-exo patterns relative to the transcriptional start sites of protein coding genes. The major peak locations for TBP, TFIIB and polymerase II in the composite plot reflect the genomic organization of human transcription initiation complexes. Once mastered, this technique can be done in four days if performed properly.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of gene regulation to explore molecular details of subnuclear structure in assymetry in yeast. Following this procedure, other methods like RNase seek expression profiling can be performed to address questions such as whether a given factor influences the expression of a nearby gene. While attempting this procedure, it's important to remember to carefully fill out master mix tables for all enzymatic steps.Don't forget, working with carcinogens and other caustic agents can be extremely hazardous and precautions such as wearing personal protective equipment should always be taken while performing this procedure. After this watching video, you should have a good understanding of how to prepare a high-quality ChIP-exo library.

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